食管癌预后相关lncRNA 的特征构建

黄向东，张兴伟

（内蒙古赤峰市医院胸外科，内蒙古 赤峰 024000）

食管癌（esophageal cancer，EC）是世界上第7 大常见癌症，也是全球第6 大致命的癌症，主要包括食管鳞状细胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）两种亚型[1]。食管腺癌在欧美国家占主导地位，而食管鳞状细胞癌在我国占主导地位[2]。目前，手术是治疗早期食管癌的首选方法，但因其恶性程度高、进展快、预后差，很多患者一经诊断就失去了手术机会。虽然现有的治疗方法在一定程度上提高了食管癌的生存率，但其5 年生存率仅为20%[3]。现阶段，尚无针对食管癌作用的靶向药物。因此，寻找早期诊断食管癌分子标志物，探索发病机制和治疗靶点具有重要意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是长度超过200 个核苷酸的非编码RNA，广泛存在于基因组中，由于其在许多生物过程中起关键作用而受到越来越多研究的关注[4]。目前有研究表明[5]，lncRNAs 在肿瘤增殖、转移和微环境中发挥重要作用，并有望成为诊断癌症、预后、转移和耐药性的生物标志物。此外，lncRNA 在不同肿瘤组织中存在着表达差异，并与肿瘤细胞的增殖侵袭以及不良预后相关[6]。本研究基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中的食管癌表达数据，探索与食管癌预后相关的lncRNA，构建食管癌患者预后预测特征，期待为食管癌患者的潜在治疗靶点提供新的证据支持。

1 资料与方法

1.1 数据来源 基于癌症基因组图谱（TCGA）数据库（https://cancergenome.nih.gov/）中下载的食管癌患者的RNA-seq 数据和相应的临床信息。排除没有完整临床数据和生存信息的样本，共得到了158 个食管癌组织样本和11 个正常邻近组织进行后续分析，见表1。基于GENCODE 项目基因注释文件（版本33，GRCh38）[7]对基因符号和生物型进行注释。

表1 样本中患者的临床数据统计

1.2 差异表达lncRNAs 和mRNAs 筛选 通过使用“edgeR”包，采用|log2FC|＞2 且P≤0.05 的筛选标准，鉴定食管癌和正常样品之间差异表达的mRNAs（DEGs）和差异表达的lncRNAs（DELs）。并通过“heatmap”和“ggplot2”包绘制DEG 和DEL 的热图和火山图。

1.3 预后模型构建 基于单变量Cox 回归分析评估总生存期（Overall survival，OS）和lncRNA 表达水平之间的相关性。对于P＜0.05 的lncRNA，进行LASSO回归分析和多变量Cox 回归分析，计算各选择lncRNA 的预后总和。基于Cox 系数和基因表达值的线性组合计算风险评分，风险评分计算如下：风险评分=∑回归系数（lncRNA）×表达值（lncRNA）。基于“survival”和“glmnet”包，根据风险评分将样本分为高风险组或低风险组，构建预测特征。

1.4 预后模型临床价值评估 使用“timeROC”和“survival”包绘制ROC 曲线并计算该模型的C 指数，评估预测签名的稳定性和准确性。并通过K-M生存分析评估预后模型中高风险和低风险人群体的生存差异。分析构建模型中lncRNAs 与临床病理特征（包括年龄、性别、病理分期和TNM 状态）之间的相关性。

1.5 功能分析 通过Pearson 相关分析来识别与预后模型中lncRNAs 具有共表达关系的mRNAs，并且|R|＞0.5 被认为是有意义的。利用“clusterProfiler”包对共表达的mRNAs 进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）功能富集分析，间接探讨lncRNAs 在高风险组和低风险组人群之间的生物学功能差异。

2 结果

2.1 DELs 和DEGs 的识别 基于TCGA 数据库，共获得169 个样本（158 个EC 样本和11 个正常样本）的数据，根据|log2FC|＞2 且P≤0.05 的纳入标准，最终鉴定出592 个DELs 和1219 个DEGs，见图1A、图1B。

图1 基因表达火山图

2.2 预后特征构建及验证 基于单变量Cox 回归分析和LASSO 回归分析，总共获得了13 个构建预后特征的DELs 见图2A。随后，基于多变量Cox 回归分析获得13 个DELs 的回归系数（Coef）以计算风险评分并构建预测特征。根据风险评分的中位数值，将158 患者分为高危组和低危组。分析高风险和低风险组中患者的分布及DELs 的表达水平，见图2B～图2D。另外，高危组患者的OS 低于低危组，见图2E。ROC 曲线结果表明1、3 和5 年的ROC（AUC）曲线下面积分别为0.762、0.773 和0.925，见图2F。同时构建了对应的列线图评估患者的1～5 年生存率，见图2G。

图2 lncRNA 预后模型

图2 lncRNA 预后模型（续）

2.3 特征的临床相关性 根据多元Cox 回归和K-M生存曲线，发现AC002331.1、LINC01068 和RP11-2N1.2 的高表达与患者的不良预后密切相关，见图3A～图3C。此外，13 个DELs 与食管癌临床特征分析表明，BLACAT1 和LINC01068 在M0 的中位表达值高于M1。RP4-781K5.5 和LINC01415 在65 岁以上人群中高于65 岁以下人群，而GK-IT1 在65 岁以下人群中高于65 岁以上人群。TSPEAR-AS2 和GK-IT1 的高表达水平与患者淋巴结转移相关。LINC01415 在无淋巴结转移患者中的表达中值高于有淋巴结转移患者。此外，RP4-781K5.5 在男性中的中值表达值高于女性，见图3D～图3L。

图3 Kaplan Meier 生存分析及EC 患者lncRNAs 表达与临床病理因素的关系

图3 Kaplan Meier 生存分析及EC 患者lncRNAs 表达与临床病理因素的关系（续）

2.4 功能分析 Pearson 相关性分析分析了与lncRNA共表达关系的DEGs，探索3 种与预后相关lncRNAs的功能和潜在分子机制。以R＞0.5 作为筛选标准。对于LINC01068，没有DEGs 符合标准。RP11-2N1.2有9 个符合标准的DEGs。对于AC002331.1，共收集了375 个DEGs，并列出了前10 个共表达DEGs，见图4。根据GO 分析结果显示，ACC02331.1 与MHC蛋白结合、MHC 蛋白复合物结合、细胞因子受体活性等功能有关，KEGG 分析结果表明与ACC02331.1具有共表达的DEGs 涉及到细胞粘附分子和抗原加工和呈递相关等相关通路，见图5。

图4 与AC002331.1 相关的前10 个共表达基因的Pearson 相关分析

图4 与AC002331.1 相关的前10 个共表达基因的Pearson 相关分析（续）

图5 AC002331.1 的共表达蛋白编码mRNAs 的功能富集分析

3 讨论

食管癌是消化系统恶性肿瘤，预后不良。虽然，近年来对于食管癌的治疗取得了一定进展,但由于食管癌的恶性程度高、复发转移率高，因此预后较差[8]。基于来自TCGA 公共数据库的数据集，多项研究评估了lncRNA 在各种癌症类型中的预后价值[9-11]。这些研究结果表明该方法是可行的。例如，PVT1 的高表达与食管癌预后不良有关[12]，而LINC01296 可促进细胞增殖、迁移和侵袭，与食管癌预后不良有关[6]。鉴于lncRNA 与多种肿瘤有着密切的关系，本研究建立了lncRNA 相关食管癌患者预后预测特征，特征中lncRNAs 对未来食管癌的诊断及治疗提供了新的方向。

本研究基于TCGA 数据库中食管癌患者的表达数据，构建了包含13 个lncRNA 的食管癌的预后预测特征，包括AC002331.1、AC079354.5、BLACAT1、GK -IT1、LINC01068、LINC01415、RP11 -169F17.1、RP11 -2N1.2、RP11 -475O23.2、RP11 -60A24.3、RP1174-17RP115.5、TSPEAR-AS2。根据风险评分将食管癌患者分为高、低风险两组，通过绘制K-M 生存曲线发现高风险组患者的生存时间显著低于低风险组（P=3e-10）。特征的1、3 和5 年的AUC 值分别为0.762、0.773 和0.925，该特征的C 指数为0.764，均表现出较好的预测能力。

在预测模型和临床病理数据相关性分析中发现，BLACAT1 和LINC01068 在M0 患者中的中位表达值高于M1。既往研究表明[13]，BLACAT1 的高表达与实体瘤患者较短的总生存期、淋巴结转移、较差TNM 分期以及肿瘤分级相关。而LINC01068 在肿瘤中的作用未得到进一步探究。此外，本研究发现RP4-781K5.5 和LINC01415 在65 岁以下患者的中位表达值低于65 岁以上患者，说明对于65 岁以下患者，这两种lncRNA 的异常表达可能会增加食管癌风险。相反，GK-IT1 不同于RP4-781K5.5 和LINC01415，它在65 岁以上的患者中具有更高的表达水平。本研究还发现存在远处淋巴结转移的患者中GK-IT1 的表达水平高于无淋巴结转移的患者。LINC01415 在没有淋巴结转移的患者中显示出更高的表达水平。此外，TSPEAR-AS2 的高表达可能与远处淋巴结转移有关，AC002331.1、LINC01068 和RP11-2N1.2 在肿瘤组织中的高表达与患者的不良预后密切相关，并进一步分析它们的潜在功能。

基于Pearson 相关系数分析获得了与lncRNAs（AC002331.1、LINC01068、RP11-2N1.2）具有共表达关系的mRNAs。其中，对与AC002331.1 具有相关mRNAs 进行功能分析，发现具有多种生物学功能，主要与MHC 蛋白结合、MHC 蛋白复合物结合、细胞因子结合受体相关。KEGG 分析表明，AC002331.1可能与细胞粘附分子、抗原加工和呈递、JAK-STAT信号通路和NF-κB 信号通路密切相关。而这些功能与癌症的发生、发展存在着密切的关联性。并且JAK-STAT 信号通路在细胞免疫、分裂和死亡以及肿瘤形成中起着至关重要的作用[14]。JAK-STAT 信号通路的突变和信号调控与白血病[15]和骨肉瘤[16]密切相关。此前的研究也表明，JAK-STAT 通路可能参与了食鳞癌管的发生[17]。Li B 等[18]和Huang H 等[19]的研究也表明，NF-kappa B 信号通路与食管癌的发展过程密切相关。

综上所述，通过分析TCGA 数据库中食管癌的数据，探索其中与食管癌预后相关的lncRNA，建立食管癌患者预后预测特征，该特征中的lncRNAs 可能为食管癌患者的诊断及治疗提供一定思路。