基于生物信息学分析GLI1 在胃癌中的表达及其临床意义

黄 灿，杨侃侃，江 兵，李启信

（安徽医科大学附属巢湖医院胃肠外科，安徽 合肥 238000）

胃癌（gastric cancer，GC）是全球第5 大常见恶性肿瘤，也是恶性肿瘤死亡的第3 大原因[1]。胃癌的发病机制十分复杂，具体机制仍不清楚。全身化疗、手术、免疫治疗和靶向治疗均已证实对胃癌有效[2]。尽管近年来较早期胃癌通过外科手术取得了一定的效果，早期手术后5 年生存率可达到60%～80%，但进展期胃癌预后较差[3]。相关基因及分子在胃癌中的异常表达在胃癌的发生发展中起着重要的作用[4]。因此，筛选胃癌诊断和治疗的新靶向分子有利于对胃癌的早期诊断和精准治疗。GLI1 是Hedgehog 信号转导途径末端的转录因子，Hedgehog 途径在癌症中异常激活有两种方式：①配体依赖模式：肿瘤通过自分泌信号过度激活Shh-GLI 途径产生高水平Shh配体；②配体非依赖模式：突变的PTCH 导致SMO结构性激活，导致GLI1 信号失控促进细胞的转化和肿瘤的发生[5]。既往有很多研究发现GLI1 与多种癌症的发生发展有着重要关系，包括结肠癌[6]、胶质瘤[7]、食道癌、膀胱癌[8]、骨肉瘤[9]、乳腺癌[10]等。但目前

GLI1 在胃癌中的研究尚不明确。本研究运用多种癌症基因数据库分析GLI1 在胃癌中的表达情况，同时探讨GLI1 基因表达对胃癌患者预后及免疫影响，旨在为深入研究GLI1 的靶向治疗提供思路。

1 资料与方法

1.1 资料来源 检索TIMER 数据库（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）检索GLI1 在泛癌中的表达情况，检索条件为：①Exploration：Gene Diff Exp；②Gene Expression:select GLI1。利用UALCAN 数据库（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）先检索GLI1在泛癌中的表达随后在STAD 中临床相关性表达的相关信息，检索条件为：①Gene symbol：GLI1；②pan-cancer view；③Gene Expression；④Select Cancer:Stomach adenocarcinoma；⑤GLI1 expression based on：Sample types，individual cancer stages，Tumor Grade，Nodal Metastasis status。进一步利用Kaplan -Meier Plotter数据库（https://kmplot.com/analysis/）分析GLI1 在STAD 中的预后，设置检索条件为：①Gene symbol：GLI1；②Cancer：gastric cancer；③Survival：OS，FP，PPS。进一步检索TIMER 数据库基因分析GLI1 的表达与免疫浸润的相关性。筛选条件如下：①Getting started by Gene：Gene Symbol：GLI1；②CancerTypes：STAD；③Immune infiltrates:selectimmunecells；④Correlationcancer types ：STAD；⑤Gene Symbol Y：GLI1；Gene Symbol X：select immune cells marker。

1.2 统计学处理 UALCAN 数据库中正常组织和肿瘤组织的GLI1 基因表达差异进行荟萃分析，P＜0.05表示差异有统计学意义，生存曲线采用Kaplan-Meier 方法，两组间生存率比较运用Log-Rank 检验通过对数秩检验分析，结果为风险比（HR），P＜0.05差异有统计学意义，TIMER 数据库中相关性采用Spearman 相关系数评价。

2 结果

2.1 GLI1 在多种肿瘤组织中的表达水平 UALCANS数据库分析发现GLI1 在胆管癌、食管癌、头颈鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、肝细胞癌、肺鳞癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌的表达均高于正常组织，见图1A。TIMER 数据库分析GLI1 在特定肿瘤组织中的差异表达，结果显示胆管癌、食管癌、头颈鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、胃癌的表达均高于正常组织见图1B。

图1 GLI1 在不同恶性肿瘤中的表达情况

2.2 GLI1 在胃癌中的表达情况 UALCAN 数据库显示，GLI1 胃癌中的表达水平高于正常对照组，且差异有统计学意义（P=4.208600024036e-09）；GLI1 在肿瘤分期中Stage（1、2、3、4）表达均高于正常组，同时Stage（2、3、4）表达高于Stage1，且差异有统计学意义。肿瘤分级中Grade（2、3）表达高于正常组，Grade3 表达高于Grade（1，2）。在肿瘤淋巴结转移中，N0、N1、N2、N3的表达高于正常组，且差异有统计学意义。

图2 GLI1 的差异表达胃癌样本类型（n=449）

2.3 GLI1 的高表达与胃癌患者的预后不良的关系Kaplan-Meier 数据库分析GLI1 在胃癌中表达预后价值的结果显示，GLI1 的高表达与胃癌的预后不良有关。高表达的GLI1 与胃癌的不良预后呈正相关。OS：（HR=2.56，95%CI：2.05～3.19，P＜1e-16）见 图3A；FP:（HR=2.29,95%CI：1.82～2.87，P=3.1e-13）见图3B；PPS：（HR=3.02，95%CI：2.37～3.86，P＜1e-16）见图3C。

图3 Kaplan-Meier Plotter 数据库中GLI1 水平与HCC 预后的关系

2.4 GLI1 表达水平与胃癌免疫浸润丰度相关性分析对TIMER 数据库的分析发现，GLI1 的表达水平与肿瘤丰度呈负相关，与B 细胞（Rho=0.112，P=3.09e-02）、CD4+T 细胞（Rho=0.523，P=4.80e-27）、CD8+T 细胞（Rho=0.235，P=5.10e-06）、巨噬细胞（Rho=0.434，P=1.74e-18）、树突状细胞（Rho=0.571，P=2.29e-33）、中性粒细胞（Rho=0.203，P=8.49e-05）均呈正相关，见图4。

图4 GLI1 表达与胃癌组织免疫细胞浸润水平的关系

2.5 GLI1 表达与肿瘤免疫细胞标志物水平相关性分析 GLI1 表达与肿瘤免疫细胞标志物水平相关性分析胃癌中GLI1 的表达与多种免疫细胞标志物正相关且具有明显的相关性（P＜0.01），与CD8+T 细胞、T细胞、B 细胞、单核细胞、肿瘤相关巨噬细胞、M1 巨噬细胞、M2 巨噬细胞、中性粒细胞、Th1 细胞、Th2细胞的免疫细胞标志物均呈正相关，见表1。

表1 GLI1 在胃癌中与免疫细胞相关标记物的关系

3 讨论

GLI1 是编码锌指蛋白家族成员之一，最初被鉴定为恶性胶质瘤的扩增基因产物而得名[11]。GLI1 是Hedgehog 信号通路（HH）末端的转录效应因子，在胚胎发育和组织模式/分化过程中受到严格调控。在正常生物体中影响生物的生长发育尤其是在细胞组织修复过程中[12]。某些恶性肿瘤中GLI1 的异常激活和高表达与促进肿瘤发生发展的许多特征有关。这些肿瘤的发生发展部分是由GLI1 在调节细胞周期、DNA 复制和DNA 损伤修复过程中的作用驱动的[13]。同时GLI1 的异常表达在某些非恶性肿瘤疾病的发生发展中同样起到重要作用，如在骨髓纤维化[14]、肺动脉高压[15]等，并且这些表达往往伴随HH 信号通路的激活。

研究发现GLI1 在多种实体肿瘤中过度表达且与预后不良相关，包括胃癌。如Yao Y 等[16]通过蛋白质印记和免疫组化研究发现胃癌组织GLI1 的表达高于正常组织，还进一步评估GLI1 的表达与临床病理因素发现GLI1 表达与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、静脉浸润和TNM 分期相关，随后细胞水平实验再次证实了GLI1 的高表达促进了肿瘤组织的增值和迁徙，同时利用动物实验验证GLL1 的靶向抑制剂提高了对CIS 的敏感性。Qi W 等[17]研究发现GLI1 的表达与胃癌的分期分级及远处转移具有相关性，但与肿瘤大小及淋巴结转移有关。且运用癌症干性相关的蛋白的共定位表明GLI1 可能是胃癌的干性相关蛋白。

本研究为了证实GLI1 在胃癌中的表达差异和免疫浸润的相关性，利用TIMER 数据库和UALCAN 数据库对GLI1 在多种癌症中的表达进行分析，发现GLI1 在多种癌症中呈现出高表达状态，且在TIMER 和UALCAN 两个数据库中胃癌中的GLI1 均表达高于正常组织。随后进一步运用UALCAN 数据库进一步分析了GLI1 在胃癌和正常组织的差异表达，具有明显相关性，GLI1 在胃癌中高表达于正常组织，且在肿瘤分期中Stage2、3、4 期的胃癌组织表达高于正常组织和Stage1 期胃癌组织。在肿瘤分级中部分高分期的肿瘤组织中GLI1的表达高于低分期肿瘤组织的GLI1 的表达，而在淋巴结分期中肿瘤组织GLI1 表达均高于正常组织，但胃癌淋巴结分期中组间的表达无明显的相关性。利用Kaplan-Meier 数据库中的数据进行分析发现GLI1 的高表达会影响患者的生存率并导致预后不良，降低患者OS，FP 及PPS。由此可以猜测GLI1在胃癌中起到促进胃癌的发生发展。

肿瘤微环境主要有肿瘤细胞中的不同免疫细胞组成，肿瘤微环境中的免疫细胞与肿瘤的发生发展有关[18]，且其中的复杂机制可能为肿瘤的免疫治疗提供策略[19]。TIMER 数据库是全面研究肿瘤免疫相关研究的综合性数据库[20]。因此本研究运用TIMER数据库进一步分析了GLI1 的表达与胃癌组织中的免疫细胞的相关性。研究表明，GLI1 的表达与肿瘤丰度呈负相关，与B 细胞的浸润无相关性，但与CD4+T 细胞、CD8+细胞、树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞浸润呈正相关。此外，本研究运用TIMER 数据库对GLI1 的表达与肿瘤细胞免疫标志物水平进行相关性分析，发现GLI1 的表达与多种肿瘤免疫细胞标志物具有明显的相关性，由此验证了GLI1 通过影响免疫细胞来影响胃癌的发生发展。以上结果表明，GLI1 在胃癌中呈现高表达状态，且预示胃癌患者的预后不良，并且在胃癌组织中与免疫浸润有关，免疫浸润与单抗。说明GLI1 在胃癌发生发展过程中可能起到促癌的作用，为GLI1 作为胃癌预防和诊断的重要肿瘤学标志物，并且作为胃癌的一个潜在的治疗靶点提供理论依据。此外，本研究结果仅从生物信息学角度进行研究分析，且研究结果尚未进行免疫组化、细胞功能试验、动物实验等相关实验进一步验证。需要进一步的实验和临床数据研究。

综上所述，通过多种数据库进行生物信息学分析发现，GLI1 在胃癌组织中呈高表达，且表达水平与患者生存预后有关。GLI1 在胃癌的发生发展机制表明GLI1 可能成为以后胃癌的分子诊断和预后标志及免疫治疗靶点。