高原低氧环境对C57BL/6雌性小鼠卵巢功能的影响*

袁 月 蒲雯婕 何毅刚 王 玲

1 甘肃中医药大学第一临床学院，甘肃省兰州市 730000； 2 甘肃省干细胞与基因药物重点实验室；3 兰州市妇幼保健院； 4 中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院

高原是一个特殊的低压低氧环境，其大气物理、地球化学生态结构与平原相差十分显著[1]。当人体急进高原，短时间内机体会因缺氧做出应激反应，而缺氧对体内物质代谢具有显著的影响进而发生各种临床症候群，称为急性高原病(Acute mountain sickness，AMS)。全世界高海拔地区常住人口约占世界总人口的 2%，缺氧是高原居民不得不面临的自然因素[2]。由于我国对高原地区基建和国家军事需求的增加等因素，使得从平原进驻高原的人群正在不断增加，因此近些年来，关于如何减轻高原缺氧对机体的损伤成为关注的热点。目前国内已有研究证实[3]，高原会使女性性激素水平出现明显变化，但具体机制尚不完全明确，因此构建高原低压低氧卵巢组织损伤的模型，是进行高原相关女性生殖系统疾病研究的关键环节之一。本研究旨在探索6 500m海拔时，不同留置时长对小鼠卵巢组织结构形态的影响，为选择合适时长进行高原低压低氧雌性小鼠卵巢功能损伤模型的建立，以及为在平原地区进行模拟高原女性生殖系统疾病预防治疗的机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 60只SPF级19～23g雌性C57BL/6J小鼠[购自斯贝福(北京)公司]，合格证号：SCXK(京)2019-0010 ，随机分为高原5d、10d、15d和20d组及对应的对照组(当地海拔)，每组12只。高原各组小鼠饲养于SPF级动物室内的低压高原舱中，温度控制在21～24℃，湿度约50%，升降速度为5～10m/s达到模拟海拔6 500m高度，每2d开舱打扫卫生、更换食水约30min，其余时间均连续模拟高原环境，昼夜12h，自由进食进水。对照组于SPF级动物室内同高原组进食方式饲养。本研究所有动物方案均符合伦理标准(科研伦理审批编号：2021KYLL124)。

1.2 主要试剂与仪器 模拟高原低压高原动物实验舱(中航工业贵州风雷航空机械有限责任公司)；TG16-WS 台式高速离心(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；多聚甲醛固定液(北京索莱宝公司)；电镜固定液(北京索莱宝公司)；光学显微镜(日本Olympus 公司)；透视电镜显微镜(Hitachi)台式离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 生理同步化：成功分组的小鼠，先饲养于同一平原环境下进行生理同步化。给予左炔诺孕酮炔雌醚片灌胃，药物浓度为人体的2倍，根据小鼠动情周期每5d灌胃1次，本次实验共灌胃2次。每日上午8—10点行阴道涂片观察小鼠动情周期的变化。

1.3.2 标本采集:分别于0d及入低压氧舱5d、10d、15d和20d后出舱称重，颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠双侧卵巢称重;右侧卵巢置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，制备连续切片；左侧卵巢置于电镜固定液4℃保存，待做透视电镜制片。

1.3.3 计算小鼠卵巢指数:取小鼠左右两侧卵巢，称湿重，计算卵巢指数(卵巢指数=双侧卵巢重量/体重×100%)。

1.3.4 HE染色观察小鼠卵巢形态:摘除小鼠右侧卵巢组织，清洗干净放置在 4%多聚甲醛中固定48h，取出卵巢组织行石蜡包埋，切片，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，分化，氨水反蓝后伊红染色，脱蜡脱水，最后中性树胶封片观察。

1.3.5 透视电镜观察卵巢超微结构:取小鼠右侧卵巢组织，置于电镜固定液4℃保存，磷酸缓冲液PB漂洗3次固定。取出卵巢组织继续磷酸缓冲液PB进行后固定、乙醇梯度脱水、丙酮渗透包埋、切片、铀铅双染色，最后透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行统计学分析，正态分布运用单因素方差分析，非正态分布进行K 个独立样本非参数检验，多组间数据统计用one-way ANOVA进行对比分析，P< 0.05(95%置信区间)为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠生理同步化 用左炔诺孕酮炔雌醚片灌胃前的小鼠阴道涂片结果显示：处于动情期27只、动情前期10只、动情后期7只、动情间期16只。1次灌胃后每日涂片，第4天涂片结果显示：处于动情期42只、动情前期6只、动情后期3只、动情间期9只；2次灌胃后继续每天涂片，在第4天涂片结果显示小鼠均处于动情期，完成生理同步。

2.2 小鼠体重及卵巢指数的变化 高原各组小鼠入出舱前后体重对比均有统计学差异(P<0.05)，其中高原5d、10d、20d组有高度统计学差异(P<0.000 1)；高原15d组有显著高度统计学差异(P<0.001)。对于卵巢指数高原组与对照组相比：对照组与高原5d、10d、15d、20d组组间有高度统计学差异(P<0.000 1)，其中高原5d组与高原15d、20d组有高度统计学差异(P<0.000 1)；高原10d组与高原20d组间有高度统计学差异(P<0.01)；高原15d组与高原20d组间差异性无统计学意义(P>0.05)。见图1～2。

图1 高原组小鼠体重对比

图2 各组小鼠卵巢指数

2.3 小鼠卵巢形态的变化

2.3.1 HE染色观察小鼠卵巢形态：见表1、图3。取材时见对照组卵巢外观呈均匀粉红色，而高原各组卵巢外观可见部分紫绀，以高原15、20d组最为明显，且高原各组较对照组的卵巢体积减小。与对照组相比：高原5d、10d、15d、20d组的HE染色显示光镜下卵巢髓质内血管增生扩张充血、水肿，部分区域有均匀红染的渗出液及红细胞碎片，卵泡及黄体内也见坏死的细胞碎片；高原各组卵巢髓质内原始卵泡和成熟卵泡数量有不同程度的减少，但闭锁卵泡数量增加。

表1 各组HE染色结果

对照组 高原5d组 高原10d组 高原15d组 高原20d组

2.3.2 透视电镜下观察卵巢超微结构：见表2、图4。观察卵巢超微结构可见对照组的卵母细胞整体结构尚可，细胞膜未见明显破损，且细胞器均匀分布，皮质颗粒(CG)数量较多，结构致密，分布细胞膜周围；线粒体(M)膜完整，嵴存在；粗面内质网(RER)膜完整；高尔基体(Go)未见明显增生肥大，自噬溶酶体(ASS)个别存在。与对照组相比：高原5d、10d、15d、20d组的电镜结果示卵母细胞、CG、M、RER、Go均随着在高海拔留置时间的延长，损伤程度呈递进式增加；ASS数量也是呈递进式增加。

表2 各组电镜结果

对照组 高原5d组 高原10d组 高原15d组 高原20d组

3 讨论

高原地区是指地势较为辽阔，且能使人体产生显著生物学效应、海拔3 000m以上的地区，约占地球表面积的1/5[4]。据报道近1/4平原人在进入高原后会发生AMS，症状主要包括头痛、恶心、疲倦及睡眠障碍等，其中约1%可发展为高原性脑水肿[5]。因有着低压低氧、强紫外线、低气温等特点，高原是作为一个独立的生态系统存在。这独特环境影响机体正常的生理机能，其中低氧是最主要的影响因素。已有相关实验验证[6]，低氧与小鼠卵泡发育减少有关。为解决因高原低氧环境所导致的疾病问题，建立动物模型是主要研究手段。对于实验动物的选择是建立模型的重要前提之一。本实验选择体内杂质少常用于在生殖、遗传领域的C57BL/6小鼠，鼠龄为8周龄，已达到性成熟期，生殖系统发育完善，可以完成自主交配，相当于人年龄阶段18～20岁。根据实验研究[7]，雄鼠的高原生殖系统损伤模型的建立选择海拔高度为6 000m。在前期预实验做海拔6 000m及7 000m，结果6 000m海拔需要28d高原组与对照组才能达到较为明显的差异；而低压氧舱高度升7 000m时，小鼠无法耐受缺氧环境，约70%鼠在第2天死亡。故本研究采用低压氧舱模拟海拔6 500m高原低压低氧环境，动态研究低压低氧对C57BL/6小鼠卵巢组织的影响，对于高原环境对人机体的影响开展高原生殖损伤研究。

下丘脑—腺垂体—性腺轴(Hypothalamic-Pituitary-Gonadal axis，HPA)可调节子宫内膜的周期性变化。为避免生理周期的不同对实验结果造成影响，使用雌孕激素药物，抑制丘脑下部—垂体—卵巢轴来抑制卵巢排卵，对小鼠进行生理同步化[8]。体重变化可以反映高原低氧环境对于小鼠摄食功能的影响[9]。对于机体的正常生长发育，每个阶段都必须有足够的食物热量提供，体重的减轻严重时会引起机体功能器官的体积改变。本次实验中，高原各组体重较对照组均下降，且相对应的高原组卵巢指数较对照组也下降。即在6 500m海拔，留置时间越长，使得小鼠体重减轻及卵巢组织部分萎缩。卵巢指数是指双卵巢重量与体重之比，正常时卵巢与体重的比值比较恒定。受损组织的重量可以发生改变，故指数也随之而改变。卵巢指数增加，表示组织充血、水肿等；指数减小，表示组织萎缩或其他退行性改变。据本次试验结果来说，虽高原各组较对照组均有改变，但高原15d组与20d组间无统计学价值，说明高原留置达15d时卵巢萎缩与20d组无差异。因此，建立6 500m高原低氧的小鼠卵巢损伤模型时长，最少需要15d。

卵巢组织病理检查是诊断卵巢储备功能的金标准。本次研究发现高原5d组小鼠卵巢体积略萎缩，虽各级生长卵泡均有分布，但卵母细胞有轻度损伤；M轻度肿胀，嵴减少；RER轻度扩张，少量脱颗粒；Go轻度肥大；ASS少量存在；髓质血管扩张，且见大量坏死红细胞。高原10d组的卵母细胞与M改变同高原5d组，但ASS数量增多；且卵巢髓质血管增生扩张明显，次级卵泡内颗粒细胞分布不均匀并有部分凋亡，闭锁卵泡增加。对于高原15d组可见卵巢组织结构已有破坏，卵母细胞重度损伤，细胞器部分崩解，M肿胀明显、基质局部稀疏、嵴减少，RER部分膜破损，ASS存在；髓质内血管增生明显、卵泡数量减少。而高原20d组同高原15d组的病理结果相似，无明显差异性。上述结果表明，模拟6 500m高原环境建立小鼠卵巢损伤模型在留置时长15d时，对小鼠卵巢组织形态影响最为明显。

哺乳动物性成熟后每个月经周期只有1个优势卵泡发育成熟并排卵，其余卵泡发育到一定程度通过细胞凋亡机制而退化，称为卵泡闭锁[10]。卵泡闭锁增多意味卵巢储备功能的下降，是导致某些无排卵性疾病的主要原因，例如多囊卵巢综合征(PCOS)和卵巢早衰(POF)。已有文献记载[11]，颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的主要原因。卵巢是一个代谢活跃的器官，能产生大量的活性氧。由于卵泡体积大，卵泡卵母细胞更容易缺氧[12]。线粒体是主要供能的细胞器，可以为卵泡发育提供所需能量，促使卵巢排出健康的卵子，发挥其生殖功能。当线粒体结构破坏，能量供应不足是诱发颗粒细胞凋亡，最终造成卵子质量低下、卵泡闭锁增多的重要原因[13-14]。本实验中发现，随着留置高原的时间延长，在高原15d组与高原20d组的卵巢生殖细胞内，线粒体肿胀明显、体积变大，且基质局部稀疏，嵴减少。因此线粒体结构破坏是导致这两组卵巢内卵泡数量减少、闭锁卵泡增加的主要原因。

综上所述，对于高原低压低氧C57BL/6雌性小鼠卵巢功能损伤模型评价指标的探索，体重变化、卵巢指数、卵巢组织病理学形态在高原5d组，已经发生变化，而高原15d和20d组时更为明显，提示在模拟海拔6 500m高原环境下，留置时长在15d已经对小鼠卵巢功能产生较为严重的损害影响。本次研究制造模型的方法:模拟6 500m海拔，分别留置时长为5d、10d、15d、20d，15℃/5℃的昼夜温差，可以更加接近高原低氧暴露环境，对于反映出低压低氧暴露对雌性小鼠卵巢功能的损伤可能更为有利，并检测得此模型具有一定的良好重现性。