复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿瘤胃发酵及菌群结构的影响

■魏倩倩马 琳刘兴医常忠娟杨乾龙赵 蒙*

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林长春 130112；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

反刍动物瘤胃具有发酵能力，其内部定植多种微生物，可将饲粮中的蛋白质和纤维等有机物分解代谢为挥发性脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸），为宿主提供必要的营养物质和代谢能量。在瘤胃微生物群中，细菌是最多样化的群体，估计其存在量为109～1010个/mL[1]。因此，瘤胃细菌是了解营养物质代谢的一个关键因素。研究发现，复方中草药添加剂能够调节菌群结构、改善瘤胃发酵和提高生产性能[2-4]。因此，可通过添加复方中草药添加剂来调控反刍动物瘤胃发酵，从而提高经济效益。特种动物增效养殖技术课题组前期研究了复方中草药添加剂对梅花鹿生产性能的影响，结果发现，生茸期梅花鹿饲喂复方中草药添加剂可获得最佳的生产性能[5]，可能与中草药添加剂影响瘤胃菌群结构有关，因此，试验通过高通量测序方法来研究复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿瘤胃发酵及菌群结构的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄芪、当归、人参、枸杞、益母草、淫羊藿等组成的复方中草药，购自亳州药材市场。

1.2 试验设计与饲养管理

选取12头梅花鹿，随机分为两组，对照组饲喂基础饲粮，试验组饲喂基础饲粮+10 g/（头·d）复方中草药添加剂，基础饲粮配方及营养水平见表1。预试期7 d，正式饲喂49 d。每天04：30 和15：30 定量饲喂，自由饮水。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.3 样品采集

试验结束时，对早饲前梅花鹿麻醉，使用瘤胃管采集瘤胃液约200 mL，为避免唾液污染，前端一半瘤胃液弃掉，剩余部分分装入5 个10 mL 的无菌离心管中，一管用便携式pH 计（中国上海PHS-3C 型）立即测定pH，其余管立即放入液氮中用于后续挥发性脂肪酸（VFA）、氨态氮（NH3-N）含量和瘤胃菌群的测定。

1.4 瘤胃发酵参数测定

瘤胃液挥发性脂肪酸（VFA）含量采用安捷伦6890 气相色谱仪测定；瘤胃液氨态氮(NH3-N)含量采用冯宗慈等[7]改进的比色法测定。

1.5 瘤胃菌群的测定与分析

试验最后1 天，晨饲前对梅花鹿进行颈静脉麻醉，采取梅花鹿瘤胃液样本放入液氮中保存。将瘤胃液样本送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行16S rDNA高通量测序。利用Uparse软件进行OTU聚类。利用Qiime软件计算α-多样性指数。

1.6 统计分析

试验数据采用SPSS 26.0 进行独立样本t检验分析，P＜0.05表示差异显著；P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿瘤胃发酵参数的影响

由表2 可知，与对照组相比，试验组的瘤胃液pH显著提高（P＜0.05），丙酸浓度显著降低（P＜0.05）。

表2 复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿瘤胃发酵参数的影响

2.2 复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿瘤胃菌群丰富度与多样性的影响

本研究共收集到10 个有效瘤胃液样本，由图1可知，基于97%的序列相似性，两组OTU 总数为4 656 个，其中对照组和试验组分别为3 587 个和2 730 个，特有OTU 数分别为1 926 个和1 069 个，分别占OTU 总数的41.37%和22.96%，两组共有OTU 数为1 661 个，占OTU 总数的35.67%，对照组梅花鹿特有OTU 数相对试验组梅花鹿较高。由表3 可知，与对照组相比，试验组Chao1 指数、Ace 指数显著降低（P＜0.05），如图2 所示，主坐标分析（PCoA）显示对照组与试验组之间的分布距离较近，说明两组的菌群结构相似[8]。

图1 OTU韦恩图

表3 复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿瘤胃细菌α-多样性的影

图2 主坐标分析

2.3 复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿瘤胃菌群组成的影响

由表4 可知，门水平上，两组的优势菌门为厚壁菌门和拟杆菌门。其中试验组厚壁菌门和广古菌门的相对丰度显著高于对照组（P＜0.05），而未分类细菌和放线菌门的相对丰度显著低于对照组（P＜0.05）。

表4 复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿瘤胃门水平上（相对丰度＞1%）菌群结构的影响

由表5 可知，属水平上，两组优势菌属均为普雷沃氏菌属，其中试验组的克里斯滕森菌科_R-7 菌属、醋酸菌属、瘤胃球菌属和瘤胃球菌科_NK4A214菌属的相对丰度显著高于对照组（P＜0.05）；糖化假丝酵母菌属、假单胞菌属的相对丰度显著低于对照组（P＜0.05）。

表5 复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿瘤胃属水平上（相对丰度＞1%）菌群结构的影响

3 讨论

3.1 复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿瘤胃发酵的影响

瘤胃是成年梅花鹿最重要的消化器官。瘤胃pH、氨态氮和挥发性脂肪酸浓度等是反映饲粮在瘤胃内发酵状况的重要指标[9]。瘤胃液pH 直接反映瘤胃健康及瘤胃内各种有机酸和代谢物产生与吸收的情况，与饲粮组成和添加剂类型关联密切[10]。正常情况下，梅花鹿瘤胃液pH 为5.6～7.5，本试验中，试验组瘤胃液pH比对照组显著提高，但均在此正常范围内，表明添加复方中草药添加剂不会影响瘤胃微生物的正常生长。NH3-N 浓度能够反映瘤胃微生物氮代谢水平，本试验中，试验组瘤胃液NH3-N 浓度提高了17.80%，说明添加复方中草药添加剂可以在一定程度上提高氮代谢水平。有研究报道，添加复方中草药（香薷、大黄、厚朴、黄芩）可以提高育肥羊瘤胃总挥发性脂肪酸、乙酸、丁酸和丙酸等浓度[11]，本试验结果与之不同，这种差异可能源于中草药的组成、功能、动物种类及动物的生理状态不同。

3.2 复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿瘤胃菌群结构的影响

本试验中，试验组Ace 指数和Chao1 指数显著降低，表明复方中草药添加剂能够降低梅花鹿瘤胃菌群丰富度，推测可能与复方中草药中的某些成分的抑菌作用有关[12]。本研究以97%的序列相似性共聚类出4 656 个OTU，其中特有OTU 数分别为1 926 个和1 069 个，分别占OTU总数的41.37%和22.96%。本研究结果表明，梅花鹿瘤胃中厚壁菌门的丰度超过拟杆菌门，与一些研究报道的拟杆菌门丰度高于厚壁菌门的结果不同[13]。这种差异可能由于饲粮结构不同导致[14]。厚壁菌门和拟杆菌门为反刍动物瘤胃的优势菌门，试验组的厚壁菌门丰度显著提高，研究表明厚壁菌门对纤维降解具有重要作用。此外，有研究报道，厚壁菌门能帮助机体有效地吸收热量并逐渐转化为脂肪，还可调控能量贮存基因的表达[15-17]。广古菌门下多为产甲烷菌，包括甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）、甲烷球形菌属（Methanosphaera）和Candidatus_Methanoplasma，本研究结果表明，试验组的广古菌门的丰度显著高于对照组，但是补充复方中草药添加剂否会增加温室气体甲烷的排放有待于进一步验证[18]。研究表明，放线菌门具有致病作用[19]，本试验中，试验组放线菌门的丰度显著降低，表明复方中草药添加剂一定程度上可以降低梅花鹿患病的风险。在属水平上，普雷沃氏菌属在两组中都是优势菌属，这与之前在梅花鹿上的研究结果一致[20]，普雷沃菌被证明可参与蛋白质、碳水化合物和半纤维素的降解[21-22]。此外，本试验还发现，试验组的理研菌科_RC9菌属的相对丰度比对照组提高了56.96%，Pitta等[23]证明理研菌科_RC9菌属参与结构性碳水化合物的降解，瘤胃球菌、瘤胃球菌科_NK4A214菌属是纤维降解菌，其相对丰度显著高于对照组，可能由于中草药本身含有的纤维类物质，为该菌提供了丰富的发酵底物[24]。钱伯钦[25]证明假单胞菌属作为一种潜在的致病菌，试验组的假单胞菌属显著低于对照组，表明复方中草药添加剂可以抑制有害菌的生长，使动物机体保持健康状态。

4 结论

本试验条件下，饲粮添加10 g/（头·d）的复方中草药添加剂可以提高生茸期梅花鹿瘤胃pH，提高瘤胃厚壁菌门、瘤胃球菌属、瘤胃球菌科_NK4A214 菌属、克里斯滕森菌科_R-7菌属和理研菌科_RC9菌属的丰度，有利于促进瘤胃对纤维物质和碳水化合物的降解。降低放线菌门和假单胞菌属丰度，对动物机体健康具有积极作用。