高效液相色谱法测定番茄酱中苏丹红I 的方法

◎梁 磊，陈春辉

（甘肃省张掖市质量检验检测研究院，甘肃 张掖 734000）

苏丹红为亲脂性偶氮化合物，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四种，主要用于工业染色，因为我国食品药品监督管理局禁止将苏丹红作为食品添加剂用于改变食品的外观和色泽。在番茄制品中，番茄红素[1]的含量是评判番茄制品等级的重要依据。但是，由于番茄红素稳定性较差，不利于长期保存，考虑到其吸收波长与苏丹红较为接近，且番茄制品中番茄红素含量的国家标准[2]以苏丹红[3]作为参考标准物质，所以，部分不法商户为了牟取利益，以添加苏丹红的方式提高番茄红素的检测值。

作为食品中非法添加的苏丹红I 色素检测方法主要包括高效液相色谱法（HPLC）[4-5]、超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS）[6]和气相色谱-质谱（GC-MS）法[7]等。其中液相色谱-串联质谱法虽灵敏度高、分辨率好，但存在较强的基质效应，对前处理要求高，检测成本较大；虽然已有报道采用免疫法[8]、电化学分析法[9]等新手段可以减少基质感染，获得较为准确的结果，但因设备或相关标准的普及程度难以大规模应用。高效液相色谱法普及性好，同时在使用二极管阵列检测器时可以通过光谱进行辅助定性，所以在苏丹红的检测上得到了广泛应用。本研究尝试以高效液相色谱法为检验方法，通过优化样品前处理方法，以期达到对番茄酱中苏丹红I 的准确检验，为日常监管与检验提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

番茄酱样品均购自当地超市。苏丹红Ⅰ标准溶液（100 μg/mL，农业农村部环境保护科研监测所）；甲醇、乙腈、丙酮、正己烷、二氯甲烷（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；中性氧化铝（100～200 目，天津光复化学试剂公司）；实验用水为密理博纯水系统（美国）制得的超纯水。

1.2 仪器与设备

LC-20A 型高效液相色谱仪（日本岛津公司），配SPD-M20A 型光电二极管阵列检测器和Labsolution工作站；SB25-120 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；涡旋仪；ME204 型电子天平（梅特勒-托利多）；移液枪（赛默飞世尔）。

1.3 标准溶液的配置

苏丹红I 标准中间液（2.0 μg/mL）：用移液枪准确吸取500 μL 苏丹红I 标准溶液，以正己烷定容至25 mL。

苏丹红I 标准工作液的配置：分别用移液枪准确吸取苏丹红I 标准中间液0.1、0.15、0.25、0.75、1.00 mL，将正己烷定容至1 mL，制成0.1、0.15、0.25、0.75、1.00 μg/mL 的标准曲线工作液。

1.4 样品的制备

精密称取10 g 样品，放入离心管，加入10 mL 水将其分散成糊状，加入30 mL 正己烷：丙酮（3:1）混合溶液，涡旋5 min，4 000 r/min 离心10 min，吸出正己烷层，重复上述操作2 遍，合并3 次正己烷，加入无水硫酸钠5 g 脱水，旋蒸至干，加5 mL 正己烷复溶，慢慢加入氧化铝层析柱，待吸附完全后，使用正己烷10 mL 进行洗脱，弃去洗脱液，然后用5%丙酮正己烷50 mL 洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干，加丙酮5 mL 复溶，过0.45 μm 滤膜后进样。

1.5 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18 色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；进样量10 μL；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min。检测波长分别为478 nm。流动相A 为0.1%甲酸水-乙腈（85:15），流动相B 为0.1%甲酸乙腈-丙酮（80:20），截取15 min 采集数据。采用梯度洗脱，见表1。

表1 梯度条件表

2 结果与分析

2.1 色谱分离条件与检测波长的选择

通过比较乙腈-水、甲醇-水、水-乙腈-丙酮等体系，分离效果并未出现较大差别。但考虑食品样品本身因制作工艺不同而导致的基质影响差异，所以在流动相中加入0.1%甲酸，让整体流动相呈现酸性，来保证洗脱时的保留时间稳定性。通过光谱结果可知，苏丹红I 色素最大吸收波长出现在478 nm 处，且在该波长下被测物无干扰，故选择该波长作为苏丹红I 的检测波长。样品检测结果见图1。

图1 苏丹红1 样品典型图谱图

2.2 样品提取剂的确定

根据苏丹红I 的化学性质，其具有较强的脂溶性，所以在提取时，直接选择具有弱极性的正己烷作为提取剂，一方面是增加苏丹红I 的提取效率，另一方面也避免了引入过多极性杂质，为后续净化提供便利条件。

2.3 净化方式的优化

因苏丹红I 化学结构中富含共轭结构，可以被氧化铝所吸附，且正己烷可以在洗脱油脂等干扰组分的同时，保证被吸附的苏丹红I 不被洗脱，所以，苏丹红I 提取液净化条件的选择在相关标准中规定为采用降活处理的中性氧化铝作为吸附剂，经正己烷淋洗去除油脂和其他杂质后，以5%丙酮正己烷溶液作为洗脱液进行洗脱。该方法中因氧化铝活性因生产厂家不同存在一定差异，且烘干温度与时间都会对其活化效率产生影响，加水降活操作也会因为检验人员操作习惯不同，存在降活不均匀，降活程度差异大等问题。所以，本方法采用105 ℃干燥2 h的充分活化方法，不进行加水降活处理，尽可能保证氧化铝活性的一致性，提高实验稳定性。同时在洗脱过程中，通过尝试不同比例丙酮-正己烷溶液，最后确定为采用含有30%丙酮的正己烷溶液作为淋洗液。通过对比，干扰峰明显减少，净化效果良好，具体参见图2。

图2 未净化（左）与经氧化铝净化（右）样品谱图

2.4 滤膜的选择

在相关标准中，对于滤膜只规定为采用有机滤膜，但在实验中发现，采用常见尼龙（Nylon）材质有机滤膜时，可以在过滤时看到滤膜上有明显的红色染料残留，而聚四氟乙烯（PTFE）、聚偏二氟乙烯（PVDF）则无明显吸附现象。考虑到日常其他实验中的通用型，最终选择PTFE 滤膜。

2.5 方法学验证

2.5.1 线性方程、检出限与定量限结果

对0.1、0.15、0.25、0.75、1.00 μg/mL 标准曲线工作液分别进样，并进行线性拟合，得到线性方程：f（x）=38 313.3×x，拟合度R2=0.999 5，曲线现行良好。同时，以S/N=3 为检出限（LOD），S/N=10 为定量限（LOQ）进行计算，得到该方法LOD 为7.4 μg/kg，LOQ为24.7 μg/kg，通过实际加标相近浓度验证，也得到了相似结果。通过与国标进行比对，本方法测得的LOD 与LOQ 完全满足常规检测。

2.5.2 准确度、回收率与精密度结果

本方法进行三水平三平行加标验证，分别称取10 g空白基质，加入0.1 mL，0.5 mL，1 mL 浓度为10 μg/mL的苏丹红I 标准溶液，制成含0.1、0.5、1.0 μg/kg 的加标样品，依照上文方法进行提取净化后，对方法的回收率和精密度进行评估，其中低水平为线性范围的最低点，准确度用加标水平的回收率评价。结果如表2 所示。

表2 加标回收率表

由表2 可知，该方法在线性范围内，均具有较稳定的回收率，其平均回收率为92.61%，不同浓度范围内RSD 在1.22%～3.41%，说明该方法的准确性良好。

取同一浓度标准品溶液（均取0.5 μg/mL），重复进样6 次，测定其峰面积并计算RSD 值，结果小于2.0%，精密度良好。

3 结语

本试验对番茄酱中苏丹红I 号检验方法进行了优化，通过对提取溶剂、检测波长的选择、流动相的优化，有效缩短了出峰时间，改善了峰形。同时，针对标准中中性氧化铝柱填料活化/降活操作不稳定的问题，通过取消降活操作，优化淋洗液比例的方式，有效提高了净化稳定性和净化效果。通过实验表明，该方法稳定性和准确性良好，精密度高，可以适用于番茄酱中苏丹红I 的日常检测。