微波消解-比色法快速检测粮食中蛋白质含量

2023-03-26江晓俊袁士猛宋宁宇

粮食科技与经济 2023年6期

江晓俊袁士猛宋宁宇

摘要：蛋白质是粮食作物最重要的营养组成之一，是人类及动物等生命活动最重要的物质基础。蛋白质含量是粮食作物品质好坏的首要评价指标。传统方法在检测粮食中蛋白质含量时存在消解时间长、检测操作繁琐、检测结果波动性大等问题，难以应用于粮食交易等需要快速检测蛋白质含量的场景。为了能够快速准确测定粮食的蛋白质含量建立了微波消解-比色快速检测法。样品处理环节采用多段微波消解方案，检测环节采用新设计的全自动蛋白质速测仪进行检测。自动化程度高可节约人力避免危险，并且大幅度缩短实验时间，由国标方法的6 h缩短为1 h。对快速法检测值与国标法检测值进行了T检验，t（d）=0.503

关键词：多段微波消解；比色法；粮食；蛋白质

中图分类号：TS210.1 文献标志码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20230624

Rapid detection of protein content in grains by microwave digestion colorimetric method

Jiang Xiaojun1，2， Yuan Shimeng3， Song Ningyu3

（ 1. Chengdu Food Inspection and Research Institute， Chengdu， Sichuan 611130； 2. National Key Laboratory for Market Regulation （Nutrition and Health Chemometrics and Applications）， Beijing 100029； 3. Changchun Changguang Sipo Spectral Technology Co.， Ltd， Changchun， Jilin 130000 ）

Abstract： Protein is one of the most important nutritional components of food crops， which is the most important material foundation for human and animal life activities. Protein content is the primary indicator for evaluating the quality of food crops. Traditional methods for detecting protein content in grains have problems such as long digestion time， cumbersome detection operations， and high volatility of detection results， which makes it difficult to apply to scenarios such as grain trading requiring rapid detection of protein content. In order to quickly and accurately determine the protein content of grains， a microwave digestion colorimetric rapid detection method was established. The sample processing phase adopted a multi-stage microwave digestion scheme， and the detection phase adopted a newly designed fully automatic protein rapid analyzer for detection. A high degree of automation could save manpower and avoid danger， and significantly shorten the experimental time from 6 hours in the national standard method to 1 hour. A T-test was conducted between the rapid method and the national standard method， with t（d）=0.503

Key words： multi stage microwave digestion， colorimetric method， grain， protein

蛋白质是粮食作物最重要的营养组成之一，是人类及动植物等生命活动的重要载体[1]，对机体的生长、发育具有不可替代的作用。粮食作物是人类获取生命必需蛋白质和氨基酸最主要和廉价的蛋白质供体。蛋白质含量已成为评价粮食作物（如大豆等）品质好坏的首要指标，是高蛋白粮食作物交易定价的关键因素。能夠准确测定粮食的蛋白质含量是粮食深加工、开发食品资源、进行深加工质量管理和改良工艺的基础。

测定蛋白质的常用方法有：凯氏定氮法[2]、恒pH滴定法[3]、气敏电极-浓度直读法[4]、双缩脲法[5]等。传统的粮油检验蛋白质含量是按国标法（GB 5009.6—2016）执行的，采用的是凯氏定氮法，首先，国标法采用浓硫酸水解，水解时间4～6 h，使得检测时间长，无法在理化检验中达到快速检测的目的；其次，水解后采用定氮仪加人工滴定的方式进行检测，测定的不确定度较大[6-7]，对实验人员操作水平要求较高，较难做到不同实验人员之间相互比对工作；再者，检测时需要使用大量化学试剂（如浓硫酸、氢氧化钠溶液和硼酸溶液等），不仅加大了检测成本，而且严重污染环境，对实验员健康存在潜在危害[8]。

微波消解法具有加热速度快、用时短、加热均匀、准确度高等显著优点[9]，蛋白质快速测定仪测定样品的蛋白质含量时，使用的消解仪可设置多段消解方案。在设定消解方案时，采取消解条件先温和后激烈的方案。温和的消解条件用以破坏细胞组织，打散糖—油—蛋白包裹基团；剧烈的消解条件用以将蛋白质消解为含氮物质。样品前处理采用微波分段式消解技术，用硫酸及过氧化氢作为消解剂，在微波高能高频的作用下将样品快速消解为铵根离子的形式游离在水解液中，缩短了消解的检测流程[10]，采用专用试剂使用比色法对溶液中氮含量进行检测，比色法代替人工滴定，提高了实验操作的重复性和易用性。本文旨在利用微波快速消解法联合比色法建立适合于粮油中蛋白质含量的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、甲基红、溴甲酚绿、硫酸、过氧化氢（均为分析纯）：重庆川东化工（集团）有限公司；蛋白质快速测定仪专用试剂：南京至匠汇创仪器有限公司。

HCD -1100型蛋白质快速测定仪、HCW -100型实验快速消解仪：南京至匠汇创仪器有限公司；ME204E型电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；8400型凯氏定氮仪：丹麦FOSS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水分测定

按GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》执行。

1.2.2 样品的蛋白质测定

称取0.1 g试样置于干燥洁净的消解罐中，加入3 mL硫酸、4 mL过氧化氢轻摇罐身使试样分散，放入消解仪中消解。消解后放入恒温冷却器快速冷却。向消解罐中加入3 mL水并摇匀。准确称取0.5 g蛋白质快速测定仪专用试剂1置于10 mL比色管中，向其中加入0.1 mL消解液，定容10 mL加入0.5 mL专用试剂2显色10 min，使用蛋白质快速测定仪进行检测。

1.2.3 消解功率对蛋白质含量测定的影响

取当年采样的大豆，按实验操作进行消解检测。消解程序设定为两个阶段，采用不同的微波功率进行消解，并遵循国标方法进行蛋白质含量的检测。实验共设4组，第一组为对照组，采用国家标准[2]方法测定蛋白质含量；其余3组为消解1组、消解2组、消解3组，均利用微波消解仪进行消解，消解功率设定如表1所示。

待消解结束后，按照国家标准[2]测定样品的蛋白质含量。

1.2.4 消解时间对蛋白质含量测定的影响

取当年采样的大豆，按实验操作进行消解检测。消解程序设定为两个阶段，固定功率采用不同的微波时间进行消解，并遵循国标方法进行蛋白质含量的检测。实验共设4组，第一组为对照组，采用国家标准[2]方法测定蛋白质含量；其余3组为消解1组、消解2组、消解3组，均利用微波消解仪进行消解，消解功率设定为：第一阶段800 W、第二阶段1 000 W。消解时间设定如表2所示。

待消解结束后，按照国家标准[2]测定样品的蛋白质含量。

1.2.5 微波消解-比色蛋白快速检测法的准确性评价

蛋白质快速测定仪利用硫酸铵标准溶液绘制内置标准工作曲线，联合微波多段快速消解，减少了检验的工作量与操作误差，提高了检测效率。针对全自动蛋白质速测仪能否准确地测定样品的蛋白质含量，进行了以下准确性评价实验。选取10份当年新采集大豆样品，按国标方法进行蛋白质含量的测定。同时采用一台蛋白质快速测定仪，按照仪器操作规程进行检测，评价快速法的检测值与国标法检测值的差异。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

配制1 000 mg/L的硫酸铵储备液，将储备液稀释为1、2、3、4、5、6 μg/mL 的标准溶液。将这些溶液按仪器的操作规程进行处理和检测，得到仪器吸光度与该点标准浓度建立标准工作曲线，如图1所示。标液质量浓度在1～6 μg/mL时吸光度与质量浓度呈良好的线性关系，其回归方程為：y = 5.315 3x + 0.084 9（r = 0.999 4）。

2.2 消解功率对检测结果的影响

如表3所示，消解1组的数据与对照组偏差较大，为3.78%～4.91%，说明略低的消解功率是无法将粮食的蛋白质无法完全消解的。消解2组和消解3组与对照组结果十分接近，偏差为-0.25%～0.35%，符合国标方法[2]规定的精密度要求，但消解2组偏差更接近0，同时在效果相当的前提下消解仪保持长时间较低功率工作有助于消解稳定。因此，消解功率设定为：第一阶段800 W，第二阶段1 000 W。

2.3 消解时间对检测结果的影响

如表4所示，消解1组的数据与对照组偏差较大，偏差为6.16%～6.71%，说明较短的消解时间是无法将粮食中的蛋白质完全消解的。消解2组和消解3组与对照组结果十分接近，偏差为-0.59%～0.53%，而消解2组的结果与国标法更为接近，符合国标方法[2]规定的精密度要求。因此，消解时间设定为：第一阶段3 min，第二阶段4 min，即微波消解粮食中蛋白质的最优消解条件为：第一阶段消解功率800 W，消解3 min；第二阶段消解功率1 000 W，消解4 min。

2.4 微波消解-比色蛋白快速检测法检测数据与国标法数据对比

如表5所示，全自动蛋白质速测仪检测值与国标法检测值进行T检验，t （d） = 0.503，查t分布表，t （0.05，30） = 2.042，t（d） = 0.503

3 结论

利用多段微波消解技术，可快速地消解样品中的蛋白质，试剂用量小，消解时间大大缩短，从国标方法（GB 5009.5—2016）规定的6 h缩减为1 h，缩短了实验时间，提高了检测效率，简化实验操作减少人为误差，避免危险操作，有效地提高了实验的准确性、重复性与再现性。微波消解-比色蛋白快速检测法可更好地服务于粮食的收购、存储、深加工的质量控制和工艺改良等环节。