LncRNA MCM3AP-AS1调控miR-19b-3p对OGD/R诱导的神经元细胞损伤的影响

江爱民 吴强 陈刚 马枭 张金武

(1赤壁市人民医院神经内科，湖北 赤壁 437300；2咸宁市中心医院神经内科)

脑缺血再灌注损伤是缺血性脑卒中溶栓等治疗后的主要并发症，神经细胞凋亡与脑缺血再灌注损伤密切相关，当脑组织缺血时炎症、氧化应激等可促进神经细胞凋亡从而造成脑组织损伤，目前脑缺血再灌注损伤的发生机制尚未完全阐明，长链非编码RNA(LncRNA)在脑缺血再灌注损伤中表达异常并可发挥重要调控作用〔1～4〕。LncRNA MCM3AP-AS1在脂多糖诱导的软骨细胞中表达水平升高，并可通过调节miR-142-3p/HMGB1促进脂多糖诱导的软骨细胞凋亡〔5〕。但MCM3AP-AS1在脑缺血再灌注损伤中的表达及其作用机制尚未可知。靶基因预测显示MCM3AP-AS1与miR-19b-3p存在结合位点，研究表明miR-19b-3p在阿尔茨海默病大鼠中表达水平降低，并可能参与阿尔茨海默病的发生及发展〔6〕。但MCM3AP-AS1与miR-19b-3p在脑缺血再灌注损伤中的作用机制尚未可知。本研究采用氧糖剥夺再复氧(OGD/R)诱导小鼠海马神经元细胞HT22建立细胞损伤模型，探讨MCM3AP-AS1/miR-19b-3p分子轴在OGD/R诱导的神经元细胞损伤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 小鼠海马神经元细胞HT22购自上海弘顺生物；Lipofectamine2000、Trizol试剂购自美国Invitrogen；反转录试剂盒、SYBR Green试剂盒购自北京天根生化；si-NC、si-MCM3AP-AS1、miR-NC、miR-19b-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-19b-3p购自广州锐博生物；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购自南京建成生物；肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6检测试剂盒购自上海酶联生物；凋亡检测试剂盒购自美国Sigma。

1.2实验分组 用含94%N2、5%CO2、1%O2的培养箱培养HT22细胞6 h，然后更换为37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养24 h〔7〕，记为OGD/R组。同时将正常培养的细胞作为Con组。si-NC、si-MCM3AP-AS1、miR-NC、miR-19b-3p mimics、si-MCM3AP-AS1与anti-miR-NC、si-MCM3AP-AS1与anti-miR-19b-3p分别转染入HT22细胞后再进行OGD/R处理，分别记为OGD/R+si-NC组、OGD/R+si-MCM3AP-AS1组、OGD/R+miR-NC组、OGD/R+miR-19b-3p组、OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC组、OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-19b-3p组。

1.3qRT-PCR检测细胞中MCM3AP-AS1、miR-19b-3p的表达水平 用Trizol试剂提取各组HT22细胞RNA后将其置于-80℃冰箱内保存。反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR，按照荧光定量PCR试剂盒说明书操作并计算目的基因相对表达量。

1.4检测MDA、SOD水平 采用反复冻融法裂解各组HT22细胞，根据试剂盒说明书分别检测MDA、SOD水平。

1.5酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α、IL-6水平 收集各组细胞培养上清液，用ELISA检测TNF-α、IL-6水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡率 收集各组HT22细胞加入预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后将500 μl结合缓冲液加入细胞沉淀，按照试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

1.7双荧光素酶报告基因检测MCM3AP-AS1与miR-19b-3p的靶向关系 WT-MCM3AP-AS1、MUT-MCM3AP-AS1分别与miR-NC、miR-19b-3p mimics共转染入HT22细胞，将其置于培养箱内继续培养24 h后收集细胞并检测荧光素酶活性。

1.8Western印迹检测Bax、Bcl-2蛋白表达 收集各组HT22细胞后加入500 μl RIPA裂解液提取细胞总蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转膜、封闭2 h，分别加入一抗(美国CST)稀释液(1∶1 000)与二抗(北京博尔西科技有限公司)稀释液(1∶2 000)，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.9统计学处理 采用SPSS21.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1OGD/R诱导的海马神经元细胞中MCM3AP-AS1与miR-19b-3p的表达量比较 OGD/R诱导的海马神经元细胞中MCM3AP-AS1表达明显上调，miR-19b-3p表达明显下调(均P<0.001)，见表1。

表1 OGD/R诱导的海马神经元细胞中MCM3AP-AS1与 miR-19b-3p表达量比较

2.2干扰MCM3AP-AS1对OGD/R诱导的海马神经元细胞炎症及氧化应激的影响 与Con组比较，OGD/R组MDA、TNF-α、IL-6水平明显升高，SOD水平明显降低(P<0.05)；与OGD/R+si-NC组比较，OGD/R+si-MCM3AP-AS1组MDA、TNF-α、IL-6水平明显降低，SOD水平明显升高(均P<0.05)，见表2。

表2 干扰MCM3AP-AS1对OGD/R诱导的海马神经元细胞炎症、氧化应激及凋亡的影响

2.3干扰MCM3AP-AS1对OGD/R诱导的海马神经元细胞凋亡的影响 与Con组比较，OGD/R组细胞凋亡率明显升高，Bax蛋白水平明显升高，Bcl-2蛋白水平明显降低(均P<0.05)，而干扰MCM3AP-AS1可抑制细胞凋亡及Bax表达，并可促进Bcl-2表达(均P<0.05)，见表2、图1。

2.4MCM3AP-AS1靶向调控miR-19b-3p starBase预测显示MCM3AP-AS1与miR-19b-3p存在结合位点，见图2。miR-19b-3p过表达可抑制共转染野生型载体WT-MCM3AP-AS1细胞的荧光素酶活性(P<0.05)，见表3。

1～4：Con组、OGD/R组、OGD/R+si-NC组、OGD/R+si-MCM3AP-AS1组图1 干扰MCM3AP-AS1对OGD/R诱导的海马神经元 细胞凋亡的影响

图2 MCM3AP-AS1的序列中含有与miR-19b-3p 互补的核苷酸序列

表3 双荧光素酶报告基因实验

2.5miR-19b-3p过表达对OGD/R诱导的海马神经元细胞炎症、氧化应激及凋亡的影响 miR-19b-3p过表达可明显降低OGD/R诱导的海马神经元细胞中MDA、TNF-α、IL-6水平和细胞凋亡率、Bax蛋白水平，而miR-196-3p表达、SOD水平和Bcl-2蛋白水平明显升高(均P<0.001)，见图3、表4。

1，2:OGD/R+miR-NC组、OGD/R+miR-19b-3p组图3 miR-19b-3p过表达对OGD/R诱导的海马神经元 细胞凋亡的影响

表4 miR-19b-3p过表达对OGD/R诱导的海马神经元细胞炎症、氧化应激及凋亡的影响

2.6抑制miR-19b-3p能够逆转干扰MCM3AP-AS1表达对OGD/R诱导的海马神经元细胞炎症、氧化应激及凋亡的作用 与OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC组比较，OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-19b-3p组MDA、TNF-α、IL-6水平和细胞凋亡率、Bax蛋白水平明显升高，SOD水平和Bcl-2蛋白水平明显降低(均P<0.001)，见表5、图4。

表5 抑制miR-19b-3p能够逆转干扰MCM3AP-AS1表达对OGD/R诱导的海马神经元细胞炎症、 氧化应激及凋亡的作用

1～2：OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC组、OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-19b-3p组图4 抑制miR-19b-3p能够逆转干扰MCM3AP-AS1表达 对OGD/R诱导的海马神经元细胞凋亡的作用

3 讨 论

LncRNA在脑缺血再灌注损伤中可发挥重要作用，例如，LncRNA MEG3通过靶向miR-485/AIM2轴而促进神经细胞凋亡从而促进脑缺血再灌注损伤〔8〕。LncRNA SNHG14通过miR-182-5p/BINP3轴诱导吞噬作用而促进OGD/R诱导的海马神经元细胞损伤〔9〕。LncRNA SNHG12通过抑制miR-199a及上调SIRT1而激活AMPK信号通路从而减轻脑缺血/再灌注损伤〔10〕。

MCM3AP-AS1在慢性阻塞性肺疾病中表达异常并可调控人支气管平滑肌细胞增殖〔11〕。MCM3AP-AS1在急性缺血性脑卒中表达水平升高，并可能参与急性缺血性脑卒中发生及发展过程〔12〕。MCM3AP-AS1通过调节miR-204-5p/FOXC1促进口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭〔13〕。但MCM3AP-AS1在OGD/R诱导的神经元细胞损伤中的表达尚未可知。本研究结果提示MCM3AP-AS1在脑缺血再灌注损伤中可能发挥调控作用，干扰MCM3AP-AS1表达可抑制OGD/R诱导的神经元细胞氧化应激，而干扰MCM3AP-AS1表达可抑制OGD/R诱导的神经元细胞炎症反应。炎症或氧化应激诱导的神经细胞凋亡是造成脑缺血再灌注损伤的重要原因之一，Bcl-2/Bax比值降低可促进细胞凋亡〔14〕。本研究结果显示，干扰MCM3AP-AS1表达可抑制OGD/R诱导的神经元细胞凋亡。但MCM3AP-AS1调控OGD/R诱导的神经元细胞损伤的分子机制仍需进一步探讨。

本研究提示，MCM3AP-AS1可能通过负向调控miR-19b-3p的表达从而发挥作用。研究表明miR-19b-3p通过靶向GRK6降解IL-1β诱导的软骨细胞外基质降解而减轻细胞炎性损伤〔15〕。脑微血管内皮细胞中miR-19b-3p表达异常可参与脑膜炎性大肠杆菌诱导的神经炎症反应〔16〕。