miR-424-5p靶向NUCKS1基因调控子宫内膜癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭

徐旗隅 董惠

(洪湖市人民医院妇产科，湖北 荆州 433200)

子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。近年来，由于肥胖症和代谢性疾病的增加，子宫内膜癌发病率逐年增加，且发病年龄更趋于年轻化〔1〕。子宫切除术联合放射治疗和淋巴结切除术的应用显著降低了子宫内膜癌的死亡率，但晚期和转移性子宫内膜癌患者的预后和生存率仍较差〔2〕。因此，阐明子宫内膜癌发生、进展的分子机制、开发有效的治疗策略对提高子宫内膜癌患者生存率、改善预后意义重大。微小RNA(miRNA)是进化保守的非编码小RNA，其通过与靶基因mRNA的3′非翻译区结合调节表达在肿瘤进展中发挥功能作用〔3，4〕。研究显示，miR-424-5p在子宫内膜癌组织中表达降低，并对子宫内膜癌细胞的生长、迁移转移具有抑制作用〔5，6〕，然而miR-424-5p在子宫内膜癌中的作用机制并未完全阐明。序列分析发现，miR-424-5p与核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物(NUCKS)1之间可能存在相互作用。已有研究证实，宫颈鳞状细胞癌NUCKS1高表达与肿瘤的进展和复发有关〔7〕。干扰NUCKS1表达显著降低胃癌细胞的增殖和侵袭性能，并诱导细胞凋亡〔8〕。然而，NUCKS1在子宫内膜癌中的功能及miR-424-5p是否通过调控NUCKS1发挥功能仍未可知。本研究探讨miR-424-5p和NUCKS1在子宫内膜癌细胞中表达情况及对宫内膜癌细胞生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂 人子宫内膜癌细胞Ishikawa、HEC-1A、AN3CA及人子宫内膜上皮细胞(hEEC)购自中国科学院上海细胞库；miR-424-5p模拟物(miR-424-5p mimics)及其对照物(miR-NC)、miR-424-5p抑制物(anti-RNA)及其对照、NUCKS1敲低质粒(si-NUCKS1)及其对照(si-NC)、NUCKS1过表达质粒(pcDNA-NUCKS)及其对照物(pcDNA-NC)购自上海吉玛制药公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海翌圣生物公司；PrimeScript逆转录试剂盒、miRNA第一链合成试剂盒、SYBR-Green Premix购于大连宝生物工程公司；凋亡试剂盒购于上海贝博生物；抗体NUCKS1、细胞周期素(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9和裂解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)-3、β-actin抗体等一抗及山羊抗兔IgG二抗购于上海赛信通公司。

1.2细胞培养 Ishikawa、HEC-1A、AN3CA细胞均使用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基培养于37℃含5%CO2的恒温培养箱中，当细胞密度达到85%时进行消化传代，每周更换2次培养液。取2×105个对数期Ishikawa细胞接种6孔板培养24 h后，通过脂质体转染将miR-NC、miR-424-5p mimics、si-NC、si-NUCKS1、pcDNA-NC、pcDNA-NUCKS1、miR-424-5p+pcDNA-NC、miR-424-5p+pcDNA-NUCKS1分别转染至Ishikawa细胞，分为miR-NC组、miR-424-5p mimics组、si-NC组、si-NUCKS1组、pcDNA-NC组、pcDNA-NUCKS1组、miR-424-5p+pcDNA-NC组、miR-424-5p+pcDNA-NUCKS1组。同时未转染为对照(NC)组。转染48 h时收集细胞实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western印迹检测转染效果，随后进行下一步实验。

1.3RT-qPCR检测miR-424-5p和NUCKS1 mRNA表达 通过Trizol试剂提取细胞中的总RNA，并检测RNA的浓度和纯度。利用PrimeScript逆转录试剂盒、miRNA第一链合成试剂盒分别合成mRNA和miRNA的cDNA。利用SYBR-Green Premix和特定的PCR引物进行RT-qPCR。以β-actin或U6作为内参基因，通过使用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。PCR引物序列：miR-424-5p：上游5′-GGCTAGTCAGCAGCAATTCATGT-3′，下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；内参U6：上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；NUCKS1：上游5′-TGCCCAAACCCAGACTAAAG-3′，下游5′-GACCCTTCATCCC-CAGATTT-3′；内参β-actin：上游5′-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3′，下游5′-CGTCATCCATGGCGAACTGG-3′。

1.4CCK-8法检测细胞活力 将各组细胞接种到96孔板中，孵育细胞24 h后加入10 μl的CCK-8试剂，培养箱中继续孵育2 h后通过酶标仪测定450 nm吸光度值(A)检测其细胞活力。

1.5Transwell法检测细胞迁移和侵袭 将Transwell室放置在24孔板中。每组取1×105个细胞(200 μl不含血清DMEM培养基稀释)接种在Transwell小室上腔，下腔加入600 μl含10% FBS的培养基。孵育24 h后，取出小室，除去Transwell膜上非迁移细胞后用甲醇固定、结晶紫染色，通过计数显微镜下随机5个视野迁移细胞数的平均值来检测其迁移能力。侵袭实验中除Transwell小室预先被基质胶包被外，剩余步骤同迁移实验。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞使用500 μl的结合缓冲液重悬，使密度达到1×105个/ml。分别加入5 μl的膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和5 μl的碘化丙啶(PI)染液，在室温下避光孵育25 min，冰上孵育，1 h内上机检测凋亡水平。

1.7Western印迹检测细胞内目的蛋白表达 向收集的细胞中加入含蛋白酶抑制剂和蛋白酶磷酸化抑制剂的裂解缓冲液，于冰上孵育裂解细胞收集含总蛋白的上清液，并通过二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量测定其浓度。将蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离、转膜、封闭后，用兔抗NUCKS1、CyclinD1、MMP2、MMP9和Cleaved-caspase-3抗体于室温条件下孵育膜1 h进行抗原-抗体反应，再加入山羊抗兔IgG二抗，将膜在室温孵育1 h后进行显影，之后分析目的条带灰度值，通过计算目的蛋白与内参β-actin的相对表达量来检测其表达水平。

1.8双荧光素酶报告实验 Starbase预测显示NUCKS1 mRNA的3′-UTR区域含有的互补序列，将含有miR-424-5p结合位点的野生(WT)NUCKS1 mRNA-3′-UTR序列或突变(MUT)系列插入到荧光素酶报告质粒获得荧光素酶报告载体。将上述两个插入后的报告载体(WT-NUCKS1、MUT-NUCKS1)与miR-424-5p mimics、miR-NC分别共转染Ishikawa细胞48 h后检测细胞相对荧光素酶活性。同时将miR-424-5p mimics、miR-NC、anti-miR-424-5p、anti-miR-NC分别转染Ishikawa细胞48 h后检测NUCKS1蛋白表达水平。

1.9统计学分析 采用SPSS25.0统计软件进行独立样本t检验、单因素方差分析和LSD-t检验。

2 结 果

2.1子宫内膜癌细胞系miR-424-5p和NUCKS1的表达情况 与hEEC细胞相比，子宫内膜癌细胞(Ishikawa、HEC-1A、AN3CA)中的miR-424-5p表达水平明显降低，而NUCKS1 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。见表1、图1。选取miR-424-5p表达较低、NUCKS1表达较高的Ishikawa细胞进行后续实验。

2.2过表达miR-424-5p对Ishikawa细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响 与NC组和miR-NC组比较，过表达miR-424-5p后可显著抑制Ishikawa细胞的A值、迁移和侵袭水平，并明显降低CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达，明显增加细胞凋亡水平及相关蛋白(Cleaved-caspase-3)表达(均P<0.05)。见图2、图3、表2。

表1 子宫内膜癌细胞系中miR-424-5p和 NUCKS1的表达

图1 Western印迹检测NUCKS1蛋白表达

2.3抑制NUCKS1表达对Ishikawa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响 与si-NC组比较，沉默NUCKS1后可显著抑制Ishikawa细胞的A值、迁移和侵袭水平，并明显降低NUCKS1、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达，明显增加细胞凋亡水平及相关蛋白(Cleaved-caspase-3)表达(P<0.05)。见表3、图4。

图2 Transwell检测细胞迁移和侵袭(结晶紫染色，×200)

1～3：NC组、miR-NC组、miR-424-5p组 A：各组细胞凋亡水平；B：Western印迹检测Ishikawa细胞内CyclinD1、MMP2、MMP9和Cleaved-caspase-3蛋白表达图3 过表达miR-424-5p对Ishikawa细胞增殖、凋亡的影响

表2 过表达miR-424-5p对Ishikawa细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡水平的影响

表3 抑制NUCKS1表达对Ishikawa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

图4 Western印迹检测Ishikawa细胞中NUCKS1、 CyclinD1、MMP2、MMP9、Cleaved-caspase-3蛋白表达

2.4miR-424-5p靶向调控NUCKS1表达 从Starbase分析结果(图5A)可知，NUCKS1的3′端和miR-424-5p的5′端存在部分的互补结合位点。将miR-424-5p mimics和WT-NUCKS1共转染至Ishikawa细胞后，其相对荧光素酶活性(0.48±0.04)与miR-NC和WT-NUCKS1共转染(1.00±0.11)比较显著降低(P<0.05)；将miR-424-5p mimics和MUT-NUCKS1共转染至Ishikawa细胞后，其相对荧光素酶活性(1.02±0.09)与miR-NC和MUT-NUCKS1共转染(1.04±0.10)比较无显著变化(P>0.05)。miR-424-5p组Ishikawa细胞中NUCKS1蛋白表达水平(0.42±0.04)与miR-NC组(0.82±0.08)比较显著降低(P<0.05)；anti-miR-424-5p组Ishikawa细胞中NUCKS1蛋白表达水平(1.11±0.10)与anti-miR-NC组(0.84±0.07)比较显著升高(P<0.05)。见图5B。

A：starbase对NUCKS1和 miR-424-5p结合进行预测；B：Western印迹检测NUCKS1蛋白的表达；1～4：miR-NC组、miR-424-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-424-5p组图5 miR-424-5p靶向NUCKS1调控NUCKS1的表达

2.5过表达NUCKS1可以逆转miR-424-5p过表达对Ishikawa细胞增殖、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡 与pcDNA-NC组细胞相比，pcDNA-NUCKS1可显著增强Ishikawa细胞中A值、迁移和侵袭能力，显著升高细胞中NUCKS1、CyclinD1及迁移和侵袭相关蛋白MMP2和MMP9表达，显著降低细胞凋亡水平及其相关蛋白(Cleaved-caspase-3)表达(P<0.05)；与miR-424-5p+pcDNA-NC组比较，miR-424-5p+pcDNA-NUCKS1组可显著增强Ishikawa细胞中A值、迁移和侵袭能力，显著升高细胞中NUCKS1、CyclinD1及迁移和侵袭相关蛋白MMP2和MMP9表达，显著降低细胞凋亡水平及其相关蛋白(Cleaved-caspase-3)表达(P<0.05)。见图6、表4。

1～4：pcDNA-NC组、pcDNA-NUCKS1组、miR-424-5p+pcDNA-NC组、miR-424-5p+pcDNA-NUCKS1组图6 Western印迹检测NUCKS1、CyclinD1、MMP2、 MMP9、MRP1蛋白表达

表4 过表达NUCKS1可以逆转miR-424-5p过表达对Ishikawa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

3 讨 论

越来越多研究发现miRNA可以调控肿瘤相关基因的表达，在各种生物学过程中发挥重要作用，包括细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、血管生成及耐药性〔9，10〕。探讨miR-424-5p在子宫内膜癌进展中的作用和机制，有望为子宫内膜癌治疗提供有效靶点。

本研究通过RT-qPCR检测miR-424-5p表达发现，子宫内膜癌细胞中miR-424-5p表达水平显著降低，与Li等〔5〕研究结果相吻合。CyclinD1是参与细胞周期转换的关键蛋白，CyclinD1表达增加促进细胞周期向S期转换具有促增殖作用〔11〕。大量研究证实，MMP-2和MMP-9与癌症的发生和发展密切相关，其参与细胞外基质的降解，是肿瘤侵袭转移过程中的关键调节剂〔12〕。本研究结果表明，miR-424-5p在子宫内膜癌中具有抑癌作用，过表达miR-424-5p可有效降低子宫内膜癌细胞的恶性生物学行为。与本研究结论类似，Piao等〔13〕指出肝癌细胞中miR-424-5p呈较低的表达水平，通过转染将miR-424-5p过表达后可诱导肝癌细胞的凋亡并降低其增殖能力。Wu等〔14〕证实miR-424-5p对肝内胆管癌细胞的侵袭、迁移和上皮间质转化进程具有抑制作用。

目前，NUCKS1已被证实与多种癌症类型中发挥作用。结肠癌中NUCKS1高表达与总体存活率和无复发生存率显著降低有关〔15〕。肝癌中敲减NUCKS1可降低肝癌细胞活力，抑制异种移植小鼠模型肿瘤形成〔16〕。此外，有研究证实miR-142-3p通过靶向下调NUCKS1可抑制胰腺癌细胞的生物学行为〔17〕。本研究发现，宫颈癌细胞中NUCKS1在mRNA和蛋白水平表达均显著升高，抑制NUCKS1表达与过表达miR-424-5p对Ishikawa细胞的增殖能力、迁移、侵袭和凋亡具有相同的作用，而转染pcDNA-NUCKS1过表达NUCKS1则具有相反的作用。进一步分析发现，miR-424-5p直接结合NUCKS1并负调控NUCKS1表达。此外，过表达NUCKS1显著逆转miR-424-5p过表达对Ishikawa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的抑制作用。提示靶向负性调控NUCKS1表达是miR-424-5p在子宫内膜癌中发挥作用的重要机制。

综上，miR-424-5p通过靶向NUCKS1可抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。