丹参素对卵巢去势骨质疏松大鼠TGF-β/Smad信号通路及骨密度的影响

彭燕琼 彭毅 杨彬 廖倩 王月 杜荣 胡汉华 孙环 马艳

(1武汉市第一医院公共卫生科，湖北 武汉 430000；2湖北省肿瘤医院消化科；3武汉市第一医院康复医学科)

绝经后骨质疏松(PMOP)是中老年妇女常见的一种全身性代谢性骨科疾病，病理特征以骨密度(BMD)减少，骨微结构破坏，骨脆性增加，骨强度降低为主，导致患者易发生骨折，明显增加中老年妇女病残、病死率〔1，2〕。丹参素是中药丹参中的多酚类活性成分，具有减轻细胞凋亡、抑制炎症的作用，可上调骨保护素(OPG)的表达，增强成骨细胞增殖分化，抑制其凋亡，促进牙槽骨成骨形成，并增加骨质疏松大鼠BMD，改善其临床症状〔3，4〕，但其药理机制目前还未研究清楚。转化生长因子(TGF)-β/Smad信号通路在成骨分化过程中起着直接而关键的作用，上调TGF-β1表达，可提高Smad3磷酸化水平，增强成骨细胞功能，促使骨形成，减轻骨量丢失，明显改善糖皮质激素及卵巢功能减退引起的骨质疏松症状，因此TGF-β/Smad信号可作为骨质疏松的一个重要治疗靶点〔5～7〕。丹参素是否可调控卵巢去势骨质疏松大鼠TGF-β/Smad信号通路的表达，目前还未见报道。本文丹拟分析参素对卵巢去势骨质疏松大鼠TGF-β/Smad信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1动物 SD大鼠购自广州相观生物科技有限公司，许可证号SCXK(粤)2018-0043，清洁级，雌性，体重(200±20)g，所有大鼠在安静、通风良好的动物房中饲养，室内环境保持清洁级，温度25℃，相对湿度55%，12 h/12 h间断照明，大鼠自由进食、饮水。

1.2主要试剂及仪器 丹参素，纯度：≥98%，货号E-1147，购自上海同田生物技术股份有限公司；雌激素(戊酸雌二醇片)，国药准字J20130009，购自拜耳医药保健有限公司;大鼠OPG酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒、大鼠核因子κB受体活化因子配体(RANKL)ELISA检测试剂盒，货号E2015-1102B、E20151102B，购自上海源叶生物科技有限公司；兔源抗TGF-β1一抗、抗p-Smad3一抗、抗Smad3一抗、抗GAPDH一抗、羊抗兔二抗，货号ab215715、ab40854、ab63403、ab181602、ab150077，购自美国Abcam公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒，货号为P0013K、P0011，购自上海碧云天公司等。双能X线骨密度测量仪，型号LUNAR-Prodigy，购自美国GE公司；骨科生物力学测试仪，型号MX-0580，购自江苏摩信工业系统有限公司；灰化炉，型号F30400-60，购自赛默飞世尔科技公司；酶标仪，型号XElx800，购自美国 Perkin Elmer 公司；蛋白电泳仪、转膜仪，型号1659001、Trans-Blot Turbo，购自美国Bio-Rad公司；低温高速离心机，型号Centrifuge 5424R，购自德国Eppendorf股份公司；凝胶成像仪，型号GIS-500，购自Miulab公司等。

1.3方法

1.3.1动物模型制备及分组给药 参考文献〔8〕制备大鼠模型：腹腔注射30 mg/kg的5%戊巴比妥钠溶液，对SD大鼠进行麻醉，俯卧位固定于操作台，经背部开腹，移除双侧卵巢，止血后缝合、消毒，5 w后，检测大鼠股骨BMD明显降低，表明模型制备成功。共建模64只，成功60只，随机分为模型组、丹参素低剂量组、丹参素中剂量组、丹参素高剂量组、雌激素组，每组12只，另取12只SD大鼠仅做背部开腹处理，不移除双侧卵巢，设为假手术组。

参照文献，以生理盐水溶解丹参素和雌激素，制备为1、2、4 mg/ml的丹参素〔9〕溶液及0.009 mg/ml的雌激素〔10〕溶液，药物处理组以10 ml/kg的剂量灌胃，假手术组与模型组大鼠以同剂量生理盐水灌胃，每天1次，持续28 d。

1.3.2大鼠股骨BMD检测及标本收集 末次给药结束后24 h，采用注射器经尾静脉取血2 ml，静置10 min，4℃，1 000 r/min，离心15 min，收集上清液，得到血清，储存在-80℃冰箱中备用；以吸入乙醚的方法麻醉大鼠，处死分离两侧股骨，去除附着组织后，置于生理盐水中漂洗干净，右侧股骨备用，采用BMD测量仪检测大鼠左侧股骨BMD，然后截断股骨，用刮匙刮取断面处约0.5 g骨组织，置于RIPA裂解液中，以匀浆机制备为匀浆液，4℃，1 000 r/min，离心20 min，取上清液，采用BCA法测定其中总蛋白浓度(具体步骤参照说明书进行)，然后将各组蛋白浓度调整相同后，储存在-80℃冰箱中备用。

1.3.3大鼠股骨骨生物力学检测 将1.3.2中的右侧股骨放置在骨科生物力学测试仪的两个支撑点上，保持水平，跨度为20 mm，然后下压探头至股骨中段，速率为10 mm/min，直至其断裂，以仪器自带的软件记录并分析数据，获得骨生物力学指标弹性模量、最大载荷、屈服载荷的数值。

1.3.4大鼠骨矿物盐含量检测1.3.2中的左侧股骨放置在烤箱中烘烤，直至重量不再变化，记录最后一次重量，记为干重，然后将其转移至灰化炉中灰化，650℃，36 h，取出灰分称量，得出灰分重量，骨矿物盐含量=灰分重量/干重。

1.3.5大鼠RANKL、OPG水平检测 取出1.3.2中血清，置于冰水浴中解冻，以ELISA试剂盒检测其中RANKL、OPG水平，具体步骤参照说明书进行。

1.3.6大鼠骨组织TGF-β/Smad通路蛋白表达检测 取出1.3.2中蛋白样品液，煮沸变性后，各组取15 μl上样，进行电泳，湿转，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，置于5%脱脂奶粉溶液中室温孵育1 h，封闭，分别以兔源抗TGF-β1一抗、抗p-Smad3一抗、抗Smad3一抗、抗GAPDH一抗溶液于4℃孵育过夜(稀释比例分别为1∶2 000、1∶2 500、1∶1 000、1∶5 000)，TBST溶液洗膜，以羊抗兔二抗溶液于室温孵育2 h(稀释比例为：1∶2 000)，TBST溶液洗膜，以增强化学发光法显色，使用凝胶成像仪对蛋白条带拍照，并采用ImageJ软件分析图片，得出蛋白相对表达水平。

1.4统计学分析 采用SPSS24.0软件单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1丹参素对大鼠股骨BMD的影响 与假手术组相比，模型组BMD明显降低(P<0.05)。与模型组相比，丹参素低、中、高剂量组和雌激素组BMD升高，且丹参素各组之间呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)，丹参素高剂量组和雌激素组BMD差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2丹参素对大鼠股骨生物力学的影响 与假手术组相比，模型组弹性模量、最大载荷、屈服载荷明显降低(P<0.05)。与模型组相比，丹参素低、中、高剂量组和雌激素组弹性模量、最大载荷、屈服载荷升高，且丹参素各组之间呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)；丹参素高剂量组和雌激素组弹性模量、最大载荷、屈服载荷差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组股骨BMD及弹性模量、最大载荷、屈服载荷比较

2.3丹参素对大鼠股骨骨矿盐含量的影响 与假手术组相比，模型组骨矿盐含量明显降低(P<0.05)。与模型组相比，丹参素低、中、高剂量组和雌激素组骨矿盐含量升高，且丹参素各组之间呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)；丹参素高剂量组和雌激素组骨矿盐含量差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.4丹参素对大鼠血清RANKL和OPG水平的影响 与对照组相比，模型组血清OPG水平明显降低，RANKL水平明显升高(P<0.05)。与模型组相比，丹参素低、中、高剂量组和雌激素组血清OPG水平升高，RANKL水平降低，且丹参素各组之间呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)；丹参素高剂量组和雌激素组血清RANKL、OPG水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.5各组骨组织TGF-β/Smad通路蛋白表达比较 与假手术组相比，模型组骨组织TGF-β/Smad通路TGF-β1蛋白表达、p-Smad3/Smad3显著降低(P<0.05)。与模型组相比，丹参素低、中、高剂量组和雌激素组骨组织TGF-β1蛋白表达、p-Smad3/Smad3升高，且丹参素各组之间呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)；丹参素高剂量组和雌激素组骨组织TGF-β1蛋白表达、p-Smad3/Smad3差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、图1。

表2 各组股骨骨矿盐含量、血清RANKL、OPG水平及骨组织TGF-β/Smad通路蛋白相对表达比较

1～6：假手术组、模型组、丹参素低剂量组、丹参素中剂量组、丹参素高剂量组、雌激素组图1 免疫印迹检测各组骨组织TGF-β/Smad 通路蛋白表达

3 讨 论

女性步入老年进程时，卵巢功能衰退，体内雌激素水平降低，破坏机体骨代谢平衡，上调RANKL表达，促进骨吸收，下调OPG表达，抑制骨形成，进而引发骨量减少，BMD降低，最终导致PMOP〔11～13〕。去除双侧卵巢是复制PMOP动物模型常用的方法，操作简便，成功率高〔14〕。本文结果表明，摘除大鼠双侧卵巢，可下调OPG表达，上调RANKL表达，降低BMD，减轻骨矿化，破坏骨生物力学，造成骨丢失，揭示模型建立成功。

骨质疏松的临床治疗药物以维生素D、钙剂、雌激素等为主，其中雌激素是治疗PMOP最常用的药物，但其长期疗效并不理想，且可增加乳腺癌和心血管疾病的患病风险，因而，寻找一种安全有效的新型药物具有重要的临床意义〔10，15,16〕。丹参素是提取自丹参的有效成分之一，对炎症反应、细胞增殖分化、骨代谢过程具有调节作用，可降低RANKL/OPG比值，抑制破骨细胞形成，防治牙槽骨吸收，并促进成骨细胞增殖，增强骨形成，明显改善骨质疏松状〔17,18〕。本文结果表明丹参素可下调RANKL表达，促进OPG表达，增强骨矿化，提高骨密度，改善骨生物力学损伤症状，并随剂量升高而作用增强，进一步证实了丹参素对骨质疏松的疗效。

TGF-β/Smad信号对骨代谢平衡具有关键的调控作用，是治疗骨质疏松的一个重要治疗靶点。研究显示，在骨质疏松病理进程中，TGF-β/Smad信号传导受到抑制，淫羊藿和女贞子水煎液可上调TGF-β1表达，增强Smad3磷酸化，抑制骨吸收，促进骨形成，缓解糖皮质激素性骨质疏松大鼠骨生物力学特性及小梁结构的损伤〔19〕。郝喆等〔20〕发现，敲除卵巢去势小鼠白细胞介素(IL)-31基因，可明显激活TGF-β/Smad信号，抑制成骨细胞凋亡，促进成骨形成，显著抑制骨质疏松的进展，改善其临床症状。本文结果表明，丹参素可激活该通路，促使Smad3磷酸化，提高卵巢去势骨质疏松大鼠骨密度，改善其骨量减少症状。

综上所述，丹参素可上调TGF-β表达，增强Smad3磷酸化，调控RANK-OPG通路表达，降低RANKL/OPG比值，增强骨矿化，促使骨形成，提高BMD，缓解骨生物力学受损，改善卵巢去势骨质疏松大鼠骨量丢失症状，激活TGF-β/Smad信号可能是其药理机制。但未对TGF-β/Smad信号下游调控机制进行深入研究，且亦未激活或抑制该通路进行对照验证，需后续进行深入研究。