蛇床子素通过PI3K/Akt/mTOR通路对糖尿病肾病大鼠纤维化及HSP90、SIRT1的影响

王晓伟 余小柱 郭二霞 王会霞 高华山

(1平顶山学院，河南 平顶山 467092；2平顶山市中医院；3平顶山市第五人民医院)

糖尿病肾病是造成终末期肾衰竭的主要因素，主要表现为肾功能降低和蛋白尿增加〔1〕。细胞自噬活化与糖尿病肾病的好转有重要关系，而细胞自噬受条件影响对细胞凋亡既可以促进也可以抑制，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)蛋白增加可激活哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)通路，进而抑制细胞自噬作用〔2〕。中晚期肾病的病理学基础主要是肾脏纤维化〔3〕。沉默信息调节因子(SIRT)1存在于细胞核中，广泛表达于哺乳动物的成熟器官中，对细胞损伤和器官具有较好的保护作用〔4〕。热休克蛋白(Hsp)90属于保守性较高的伴侣分子，广泛存在于生物体内，可通过结合功能蛋白保证蛋白分子能正常折叠并维持其功能〔5〕。蛇床子素是从中药蛇床子中提取出的主要活性成分，具有抗氧化、抗凋亡及抗炎作用，且对肝细胞的增殖分化具有明显的促进作用〔6〕。因此本文研究蛇床子素通过PI3K/Akt/mTOR通路对糖尿病肾病大鼠纤维化及HsP90及SIRT1的影响。

1 材料与方法

1.1动物 48只雄性SD大鼠，SFP级，体重(200±20)g，动物许可证号：SYXK(京)2019-0054。

1.2试剂与仪器 蛇床子素(广东海赛特药业有限公司，国药准字Z20191001)；PI3K抗体(Cell Signaling公司)；Akt抗体(Affinit公司)；兔抗SIRT1多克隆抗体(美国LSBio公司)；尿微量白蛋白酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)；Anti-Hsp90α和β抗体(Abcam公司)；电泳仪和聚合酶链反应(PCR)仪(美国伯乐公司)。

1.3分组与造模 将大鼠随机分为6组，每组8只，一组为正常组，其余5组均给予造模。所有大鼠均正常饲养，喂养3 d后，将除正常组外的所有大鼠均给予腹腔注射55 mg/kg链脲佐菌素，正常组给予等体积的柠檬酸缓冲盐。给药后对大鼠饮食、饮水量和24 h的尿量进行观察，并于72 h后于大鼠尾尖采血，测定空腹时血糖，检测尿糖情况，连续3 d，当大鼠空腹血糖高于16.7 mmol/L或随机血糖大于22.2 mmol/L，表示尿糖为强阳性，尿量比正常组尿量多150%，且连续3 d达到上述标准，表示糖尿病大鼠造模成功。将造模后大鼠随机分为5组：模型组、不同剂量治疗组(分别灌胃蛇床子素1、10、20和50 mg/kg)，正常组和模型组分别给予相同体积的生理盐水。

1.4观察参数 分别于给药前和给药8 w后，测定大鼠血糖变化；收集大鼠24 h的尿液，测定24 h尿微量白蛋白；取血检测大鼠血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)，并计算肌酐清除率(Ccr)。采用Western印迹检测方法，取大鼠肾组织，匀浆，加磷酸盐缓冲液(PBS)离心后裂解，将总蛋白提取出来，并用二喹啉甲酸(BCA)蛋白试剂盒对蛋白的浓度进行测定。然后以actin为内参，通过电泳，转模，抗体赋予和显色成像测定PI3K和Akt蛋白相对表达量。

1.5RT-聚合酶链反应(PCR)检测 取肾组织匀浆后提取总RNA，通过逆转录合成cDNA并以该cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为95℃变性30 s、预变性5 s，然后60℃退火，30 s，循环40次。计算SIRT1、Hsp90α和Hsp90β mRNA表达情况。

1.6Western印迹检测 取肾脏组织，匀浆后离心提取总蛋白，测定蛋白浓度。然后进行电泳、转模、抗体孵育过夜，电化学发光(ECL)化学发光法成像，测定大鼠SIRT1、Hsp90α和Hsp90β 蛋白表达情况。采用ImageJ软件进行半定量。

1.7肾脏组织病理染色 实验结束时，取部分肾脏组织，多聚甲醛固定，脱水，包埋石蜡，切片，苏木素-伊红(HE)染色，用后置光学显微镜观察肾脏的病理情况。

1.8肾纤维化检测 采用Western印迹检测纤维化相关蛋白：肾脏Ⅳ型胶原蛋白、纤联蛋白(FN)、基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(TIMP)-1和MMP-9，具体步骤如下：匀浆，裂解，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，电泳、转模、加抗体室温孵育2 h，以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参，ECL化学发光法显影，采用ImageJ软件进行半定量。

1.9统计学方法 采用SPSS22.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组血糖和尿微量白蛋白水平变化 模型组血糖和尿微量白蛋白均显著高于正常组(P<0.05)，蛇床子素不同剂量组上述参数与模型组相比均显著降低(P<0.05)，且具有剂量依赖性。见表1。

表1 各组血糖、尿微量白蛋白、Scr、BUN、Ccr、PI3K及Akt水平变化

2.2各组Scr、BUN和Ccr水平变化 模型组Scr和BUN水平显著高于正常组，Ccr水平显著低于正常组水平(均P<0.05)；与模型组相比，蛇床子素不同剂量组Scr和BUN水平均降低，Ccr水平均增加，当剂量达到20和50 mg/(kg·d)时显著(P<0.05)。见表1。

2.3各组PI3K和Akt蛋白表达 模型组PI3K和Akt水平显著高于正常组(P<0.05)，蛇床子素不同剂量组与模型组相比，PI3K和Akt水平均降低，且具有剂量依赖性，剂量达到10、20、50 mg/(kg·d)时PI3K明显降低(P<0.05)，剂量达到1、10、20、50 mg/(kg·d)时，Akt明显降低(P<0.05)。见表1、图1。

2.4各组SIRT1、Hsp90α和Hsp90β mRNA表达模型组SIRT1 mRNA表达水平显著低于正常组(P<0.05)，蛇床子素不同剂量组与模型组相比，SIRT1 mRNA表达水平均显著增加(P<0.05)；各组Hsp90α和Hsp90β mRNA表达水平均无显著差异(P>0.05)。见表2。

1～6：正常组、模型组、蛇床子素1、10、20、50 mg/kg组图1 各组PI3K和Akt蛋白表达

表2 各组SIRT1、Hsp90α和Hsp90β mRNA及肾脏Ⅳ型胶原蛋白、FN、TIMP-1、MMP-9蛋白表达

2.5各组SIRT1、Hsp90α和Hsp90β蛋白表达 模型组SIRT1 蛋白表达水平显著低于正常组(P<0.05)，蛇床子素不同剂量组与模型组相比，SIRT1 蛋白表达水平均显著增加(均P<0.05)；各组Hsp90α和Hsp90β 蛋白表达水平均无显著差异(P>0.05)。见表2、图2。

1～6：正常组、模型组、蛇床子素1、10、20、50 mg/kg组图2 各组SIRT1、Hsp90α和Hsp90β蛋白表达

2.6各组肾纤维化情况 与正常组相比，模型组肾脏Ⅳ型胶原蛋白、FN和TIMP-1水平显著增加，MMP-9显著降低，蛇床子素不同剂量组肾脏Ⅳ型胶原蛋白、FN和TIMP-1水平均显著低于模型组，MMP-9水平显著高于模型组水平(P<0.05)，且呈现剂量依赖性。见表2、图3。

1～6：正常组、模型组、蛇床子素1、10、20、50 mg/kg组图3 各组肾纤维化相关蛋白表达水平

2.7各组肾脏组织病理情况 与正常组比较，模型组肾小球肥大，肾小球数量增加，伴有肾小球系膜扩张和基底膜厚度增加，肾小管有空泡变形。蛇床子素不同剂量组肾小球肥大、增生及系膜扩张和基底膜变后现象均较轻，其中高剂量治疗组改善最显著。见图4。

图4 各组肾脏组织病理(HE染色，×400)

3 讨 论

糖尿病肾病是糖尿病主要的慢性微血管并发症，主要病理包括肾小球基底膜便后和系膜扩张、肾小球硬化、肾小管空泡变性及肾间质纤维化〔7〕。研究发现肾脏细胞自噬对糖尿病肾病具有改善作用，影响自噬作用的信号通路有多种，通过增加上游PI3K/Akt蛋白表达水平可激活mTOR通路，进而对细胞自噬起到一定的调节作用〔8，9〕。以往研究结果显示蛇床子素可以降低糖尿病模型大鼠p-Akt蛋白的表达水平，而使用PI3K抑制剂后对p-Akt蛋白的表达水平有抑制作用，证明蛇床子素对PI3K/Akt/mTOR通路具有抑制作用〔10〕。与本研究结果一致。

Scr是内生肌酐，在反映患者肾损伤方面准确度较高，是肾功能变化的重要参考指标，其被肾小球率过后可随尿液被排出，且与尿量无关，患者肾损伤时Scr水平增加〔11〕。BUN属于体内蛋白代谢产物，在血液中以小分子形式存在，经肾小球过滤进原尿，之后大部分又被肾小管重吸收，当肾受损时，导致血中BUN水平升高〔12〕。Ccr是评价肾功能的重要参数，可用于评估肾小球的滤过率〔13〕。本研究结果提示，蛇床子素抑制了PI3K/Akt/mTOR通路，激活肾脏细胞自噬保护机制，改善肾脏病理及肾功能。

肾脏Ⅳ型胶原蛋白和FN可导致肾间质纤维化和肾小球硬化〔14，15〕。MMP-9与肾纤维化具有密切关系，细胞外基质累积会引起肾小球硬化和肾纤维化，而MMP-9对细胞外基质的降解具有促进作用〔7，16〕。TIMP对MMP-9的活性具有抑制作用，进而维持细胞外基质降解和沉积两者之间的平衡〔17～19〕。本研究结果提示，蛇床子素可通过PI3K/Akt/mTOR通路对改善糖尿病肾病大鼠纤维化。

SIRT1是乙酰化酶组蛋白家族的基因，广泛表达于成熟器官中，可调节能量代谢，具有抗氧化、抗感染及抗细胞凋亡作用，可通过调节信号通路保护细胞，维持器官功能，降低细胞损伤〔20，21〕。Hsp90具有良好的蛋白折叠及功能维护作用，可有效抵抗热应激和氧化作用对蛋白功能的影响，包括Hsp90α和Hsp90β两个亚型，其在内皮细胞、细胞骨架和细胞核中均有存在〔22〕。本研究结果提示，蛇床子素上调糖尿病肾病大鼠SIRT1表达水平。主要原因是蛇床子素可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路降低肾脏细胞损伤，起到抗感染和抗氧化作用，进而保护肾脏细胞〔23〕。

综上，蛇床子素可以降低糖尿病肾病大鼠尿微量白蛋白，降低肾组织病理损伤，可能与PI3K/Akt/mTOR通路有关，且可以上调SIRT1表达水平，降低肾纤维化，对HSP90表达水平无明显关系。