靶向沉默MALAT-1联合化疗对人喉鳞癌裸鼠移植瘤Fas/FasL信号通路的影响

王帅帅 许尧生 张义

(衡水市人民医院，河北 衡水 053100)

喉癌是一种来源于喉黏膜上皮组织的恶性肿瘤，原发部位在喉部，以鳞状细胞癌最为常见，好发年龄为50～70岁，男性较为多见〔1〕。其发生与长期酗酒、吸烟、有害物质的吸入及乳头状瘤病毒入侵感染有关，由于该病发病较隐匿，患者就诊时往往已发展为中晚期。喉鳞癌的发病率较高，在耳鼻喉科中仅次于鼻咽癌和鼻窦癌，居第三位〔2,3〕。喉鳞癌的症状为呼吸及吞咽困难、咳嗽、声嘶、颈部淋巴结转移等，临床治疗主要采用手术或联合放化疗方式，但也会不同程度地降低患者喉部功能而导致生活质量的下降〔4〕。近年来放射性治疗广泛应用于晚期喉癌患者和保留喉部功能的多学科治疗中，但也有少数患者在临床治疗中出现辐射抵抗，治疗效果不佳〔5〕，因此急需探索新的治疗方案提高治疗敏感性。

长链非编码RNA(LncRNA)是一段由哺乳动物基因组转录形成的非编码RNA，它在人体不同细胞和组织中的表达量有所不同，在多种癌组织中异常表达，肺腺癌转移相关因子(MALAT)-1是LncRNA家族中的一位重要成员，可参与喉癌细胞增殖、侵袭及迁移的发生和发展过程〔6〕。细胞凋亡对肿瘤有负调节作用，凋亡信号的异常可导致人体集体平衡发生紊乱，从而降低癌细胞死亡率，而Fas/FasL信号作为与细胞凋亡密切相关的成员之一，可促进凋亡〔7〕。喉癌细胞中Fas和FasL的表达比正常细胞低，因此可用于检测癌症患者的病情状况〔8〕。关于喉癌与MALAT-1及其具体机制的研究较少，因此本文探究靶向沉默MALAT-1联合化疗对人喉鳞癌裸鼠移植瘤Fas/FasL信号通路的水平变化及临床意义。

1 资料与方法

1.1材料和试剂 中国科学院上海细胞生物研究所购得人喉鳞癌细胞株Hep-2，培养条件为杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)+10%胎牛血清+青霉素+链霉素，在37℃、饱和湿度、体积分数为5%CO2的条件下进行培养。顺铂注射液(云南植物药业有限公司)，规格：2 ml/10 mg，国药准字(H53021740)。

1.2MALAT-1重组质粒的构建 设计合成2对引物，第1对引物用于聚合酶链式反应(PCR)调取扩增目的基因：正义链5′-GAGGUGUAAAGGGAUUUAUTT-3′；反义链5′-AUAAAUCCCUUUACACCUCTTT-3′。第2对引物根据载体本身序列和目的基因进行设计，通过PCR扩增获得目的基因MALAT-1 cDNA片段，经过消化、切割、连接，再转化、涂板、挑取克隆、扩增，用试剂盒提取质粒、酶切，最后经过PCR凝胶电泳鉴定，测定序列验证后得到纯化的MALAT-1重组质粒。

1.3细胞转染 收集对数生长期的Hep-2细胞，用0.25%胰酶消化后接种于6孔板，每孔1×106个，待细胞长满至80%左右时，更换无血清细胞培养基进行转染实验，将细胞分为两组：空白对照组和实验组，采用LipofectamineTM2000试剂盒将空白对照组加入Opti-MEM，实验组加入MALAT-1 siRNA进行转染实验，转染后收集MALAT-1转染和未转染的Hep-2细胞用于后续实验。

1.4建立裸鼠模型 选择28只雄性、5周龄的Balb/c健康裸鼠，购自中国医学科学院附属肿瘤医院实验动物中心。将裸鼠分为两组，分别将处于对数生长期的转染和未转染MALAT-1的Hep-2细胞以每只2×106个细胞注射于裸鼠的颈背部，在净化空气层的隔离室中继续饲养，给予灭菌处理过的水和饲料。待裸鼠的移植瘤直径达到8～10 mm时表明移植瘤成功。选取肿瘤大小均匀的裸鼠20只，其中转染和未转染MALAT-1重组载体的裸鼠各10只，将两组再随机分为2组，共4组，每组5只。分组为：Ⅰ重组载体+顺铂组，Ⅱ重组载体组，Ⅲ顺铂组和Ⅳ空白对照组。其中Ⅰ、Ⅱ组为转染MALAT-1载体组。向Ⅰ和Ⅲ组每只注射剂量为2 mg/kg的顺铂，Ⅱ和Ⅳ组分别注射等分体积的生理盐水，所有组隔天注射一次，注射2 w后采用颈椎脱位法将裸鼠脱颈处死，解剖取裸鼠肿瘤组织，放于4%甲醛中固定，采集数据并处理。

1.5观察指标

1.5.1移植瘤体积变化 在给药过程中每天用游标卡尺测量裸鼠肿瘤的长径(a)和短径(b)，并计算肿瘤体积(V)，V=1/2ab2。

1.5.2MALAT-1表达水平 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测4组细胞MALAT-1中mRNA表达水平。取出收集的肿瘤组织，反复研磨使组织充分裂解。根据Trizol试剂盒说明提取细胞的总RNA，然后将RNA反转录为cDNA。再进行PT-PCR反应，使用SYBR试剂盒进行操作：SYBR Premix 10 μl，H2O 8 μl，cDNA 1 μl，正反向游引物各0.5 μl。反应程序为：95℃ 3 min，95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共计30次循环。采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)为内参，用2-ΔΔCt法计算MALAT-1中mRNA的相对表达量。

1.5.3磷酸化蛋白(p-PI3K)和丝氨酸蛋白激酶(p-Akt)蛋白表达 采用Western印迹法检测4组中p-PI3K和p-Akt蛋白的表达情况。称取40 mg肿瘤组织，切碎后用匀浆机匀浆，离心得到上清液。提取总蛋白，按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白试剂盒检测p-磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和p-蛋白激酶B(Akt)的蛋白表达量。将蛋白样品与上样缓冲液按照1∶4的比例混匀上样，加入样品指示剂升高电压至120 V，结束后将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，转膜完成后用脱脂牛奶封闭90 min，加入一抗，4℃孵育过夜，用Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)清洗后加入二抗，90 min后显色，采用Tanon600图像分析系统对蛋白表达进行定量分析。

1.5.4Fas和FasL基因表达 采用qRT-PCR检测各组肿瘤组织中Fas和FasL蛋白的表达情况。称取40 mg肿瘤组织，在研磨器中将肿瘤组织研磨成粉末，加入Trizol裂解细胞。然后扩增Fas和FasL片段，经染色后扫描各条带的吸光度值，并计算mRNA水平相对值。

1.5.5Ki67指数和缺氧诱导因子(HIF)-1α的表达 采用免疫组织化学方法检测肿瘤组中的数和HIF-1α的表达情况。摘取裸鼠肿瘤后，用4%的甲醛固定24 h后，将肿瘤组织切成Ki67指厚为5 μm的小块，再次固定30 min，用流动水冲洗1 h，放入自动脱水机逐渐脱去水分，置于二甲苯中，再进入浸蜡过程，用石蜡对肿瘤进行包埋，用链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶链接(SP)法进行免疫组化染色，采用的一抗为鼠抗HIF-1α和鼠抗Ki67(中杉金桥生物公司)，以磷酸盐缓冲液(PBS)作为一抗的阳性对照。每张肿瘤切片在400倍高倍镜下选取至少5个视野，每个视野选取100个细胞，Ki67指数为每张切片阳性表达的细胞占比百分数。阳性表达细胞为棕褐色或棕黄色，阴性表达细胞不显色。

在细胞核和细胞质存在HIF-1α蛋白，HIF-1α蛋白阳性染色为棕黄色，染色程度按照免疫组化半定量分析〔9〕的方法，每张肿瘤切片在400倍高倍镜下选取至少5个视野，每个视野选取100个细胞，参照阳性细胞占总细胞的比例进行计分：阳性细胞百分数<5%为0分，5%～25%为1分，26～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色强度也分为4个等级：细胞基本未见着色为0分，着色为淡黄色为1分，着色为黄色为2分，着色为棕褐色为3分。最终HIF-1α表达评分结果为阳性细胞百分比×染色强度得分。

1.6统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、χ2检验及方差分析。

2 结 果

2.1移植瘤体积比较 治疗前，4组移植瘤体积相近(P>0.05)，治疗2 w后，相比Ⅳ组，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组肿瘤体积均明显低于Ⅳ组，其中Ⅰ组移植瘤体积减小程度最高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 移植瘤体积、MALAT-1 mRNA及p-PI3K、p-Akt蛋白表达比较

2.2MALAT-1mRNA表达水平比较 治疗后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组肿瘤组织中MALAT-1 mRNA的表达水平显著低于Ⅳ组，其中Ⅰ组MALAT-1 mRNA的表达水平最低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平比较 治疗后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组肿瘤组织中p-PI3K和p-Akt表达水平均显著低于Ⅳ组，其中Ⅰ组各水平最低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.4Fas指数和FasL基因表达水平比较 治疗后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组肿瘤组织中Fas指数和FasL基因表达水平均高于Ⅳ组，其中Ⅰ组Fas指数和FasL基因表达水平最高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.5Ki67指数和HIF-1α表达水平比较 治疗后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组肿瘤组织中Ki67指数和HIF-1α表达水平均低于Ⅳ组，其中Ⅰ组Ki67和HIF-1α基因表达水平最低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 Fas指数、Ki67指数、FasL基因及 HIF-1α表达水平比较

3 讨 论

喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，对于患者来说，非手术疗法相比手术可更直接保留患者喉部的正常生理功能，而放化疗是更有效的治疗方式〔10〕。放化疗是治疗喉癌和复发性喉癌的主要治疗手段，然而由于组织细胞周期、低氧等原因而改变细胞的生存环境，常导致喉癌对化疗不敏感而产生耐药〔11〕。有研究显示，肿瘤细胞对化疗产生耐药的主要原因是肿瘤细胞对凋亡产生耐受，细胞中的凋亡因子如B细胞淋巴瘤(Bcl)-2蛋白的高表达可控制细胞凋亡，导致肿瘤细胞降低对化疗药物的敏感性〔12〕。

MALAT-1是位于人染色体的一个基因片段，可参与多种肿瘤细胞的增殖、侵袭等生理过程，但其与信号通路的关联性及具体的作用机制至今尚未得到阐明〔13〕。有研究显示，肿瘤组织中MALAT-1呈高表达水平，可通过调控细胞周期过程而促进肿瘤细胞的增殖〔14〕。研究表明〔15〕干扰MALAT-1的水平可通过阻滞肿瘤细胞的G0/G1周期进而降低前列腺癌的增殖率，使细胞凋亡率显著升高。本研究结果显示，靶向MALAT-1联合化疗可有效降低MALAT-1在喉癌细胞中的表达水平，对治疗喉癌更为有效，与谭建成等〔16〕研究一致。有研究发现肿瘤直径越大，其肿瘤组织中MALAT-1水平越高，而靶向沉默MALAT-1可有效促进喉癌细胞的凋亡过程，证实MALAT-1参与喉癌细胞的增殖过程〔17〕。顺铂是治疗卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、喉鳞癌等多种实体肿瘤的常用化疗药物，主要作用靶点为DNA，有研究显示，当用RNAi下调MALAT-1后，某些肿瘤细胞将对顺铂的化疗敏感性提高，抑制细胞的增殖〔18〕，因此靶向沉默MALAT-1联合化疗可有效抑制喉癌细胞的增殖和迁移，进而抑制肿瘤组织的生长。

PI3K/Akt信号通路也是一条抑制凋亡的重要通路，活化后的PI3K可激活下游蛋白Akt，进而调节下游中其他凋亡相关基因，抑制细胞中的神经元发生凋亡。研究显示PI3K/Akt信号通路在促进咽喉部的肿瘤增殖和凋亡过程中发挥重要作用〔19〕，因此下调PI3K/Akt信号通路可有效阻滞喉癌细胞的增殖。本研究显示下调MALAT-1可干扰PI3K/Akt信号通路而诱导细胞凋亡。顺铂作为一期治疗常用的化疗药物，可以激活多种信号转导通路，最终活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抑制细胞凋亡而导致耐药〔20〕。而MALAT-1沉默后可干扰PI3K/Akt信号通路，使Caspase-3和Caspase-9磷酸化而失活，抑制Caspase导致的细胞凋亡，从而逆转耐药，增强化疗药物顺铂的细胞毒性，增加化疗效果〔21〕。

细胞凋亡还有一条由Fas与FasL结合的主要通路，Fas属于肿瘤坏死因子受体家族中的成员之一，是细胞表面的受体，Fas在正常情况下表达于人各种组织和器官中，但在人肿瘤组织中Fas表达受到限制，出现表达功能丧失〔22〕。FasL是Fas的天然配体，分子量为40 kD，小鼠的Fasl基因与人类有高达76.9%的同源性。Fas与配体FasL结合后，能诱导Fas分子形成三聚体，这种三聚体可传递各种信号，启动T细胞产生凋亡信号，激活Caspase 1、3、6、7从而引起细胞的凋亡〔23〕。大量实验已证实，T淋巴细胞杀伤靶细胞是通过Fas/FasL信号通路为基础的。其机制可能是肿瘤细胞中的Fas与FasL结合后，凋亡途径被激活，细胞的自我凋亡效果明显。但研究者检测出大量喉癌、肺癌患者肿瘤组织中Fas表达量显著低于癌旁组织和正常人体组织〔24〕，因此需要采取有效的治疗措施提高癌细胞中Fas的表达，通过Fas/FasL信号系统诱导细胞凋亡。有研究显示〔25〕，癌症患者应用顺铂后，能上调Fas和FasL mRNA的表达，随着Fas的表达水平上调，宿主淋巴细胞的凋亡数量也明显增加。而靶向沉默MALAT-1也可以上调Fas/FasL系统，因此将两者联合治疗起到协同作用，与本研究结果一致。

HIF-1α是对缺氧状态进行调控的关键因子，在机体内能够调节细胞内氧平衡，激活缺氧反应基因的表达，对维持肿瘤增殖和转移起到重要的作用，研究发现其在人鼻咽癌、喉鳞癌中都有不同程度的较高表达水平，而抑制HIF-1α表达可有效改善喉鳞癌等癌症的化疗抵抗〔26〕。Ki67指数可作为肿瘤预后指标，其表达水平与肿瘤组织分化程度成正相关，在喉鳞癌等组织中表达呈阳性〔27〕。本研究显示，联合用药后可显著下调Ki67和HIF-1α的表达水平。有研究显示〔28〕，随着顺铂浓度的升高，Ki67的表达显著减弱，成剂量依赖性，原因可能是Ki67是与细胞增殖有关的抗原，而顺铂抑制细胞的增殖过程，从而影响Ki67的表达水平。同时靶向沉默MALAT-1也可通过调控下游信号通路中Capase-3的活性而影响Ki67和HIF-1α的表达〔29〕。