橄榄苦苷对大鼠脊髓损伤模型神经功能恢复的治疗作用

向梅 张挺

(武汉市武昌医院 武汉科技大学附属武昌医院，湖北 武汉 430063)

脊髓损伤(SCI)是一种导致永久性残疾的严重创伤。其病理过程分为两个阶段：原发性损伤是由脊髓组织直接破坏引起的；继发性损伤包括轴突破坏、神经元死亡、炎症、血脑屏障破坏、缺氧和缺血〔1,2〕。继发性损伤期间的这些事件导致神经元死亡和功能障碍，导致SCI后有限的功能恢复〔3〕。因此，目前对于中枢神经系统(CNS)损伤的治疗主要侧重于通过减少神经元死亡和修复功能性神经进而预防或减少继发性SCI〔4，5〕。

橄榄苦苷(OE) 属于环烯醚类葡萄糖苷，广泛存在于木犀科植物中，在油橄榄叶中含量尤为丰富，具有器官保护、降血脂、降血压、降血糖、解毒、抗氧化、抗炎及抗肿瘤等多种药理作用〔6～9〕。近年来OE对神经损伤的保护作用逐渐引起了人们的关注。研究说明OE在人胶质母细胞瘤细胞中具有有效的抗氧化特性，可以对神经元发挥其保护作用〔10〕；另外其对大鼠神经元损伤具有保护作用，该作用与抑制炎性反应有关〔11〕。本研究旨在阐明OE是否可通过抑制免疫炎症反应进而发挥对SCI大鼠神经元的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及材料 OE购自陇南田园油橄榄科技开发有限公司(纯度>98%)，成年雌性SD大鼠购自上海SLAC实验动物有限公司(中国，220～250 g，n=45)随机分为3组，假手术(Sham)组、SCI组和SCI+OE组，水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔麻醉，SCI组和SCI+OE组行T9椎板切除术，用血管夹(Oscar，中国)造成中度挤压伤，30 g力作用1 min，Sham组仅行T9椎板切除术。术后护理包括每日两次膀胱排空和腹腔注射头孢唑啉钠(50 mg/kg)。术后SCI+OE组每天灌胃给予OE(50 mg/kg)〔12〕。Sham组和SCI组给予等量生理盐水。

1.2行为分析 对各组大鼠术后7、14、21和28 d进行脊髓损伤(BBB)评分、斜面测试实验及足迹试验，并对收集到的足迹进行分析和评估。

1.3组织学染色 在SCI后第28天，大鼠麻醉并经心脏灌注0.9%氯化钠，然后用4%多聚甲醛(PFA)固定。收集包含病变部位的T7～T9脊髓段，在4%PFA中固定48 h，然后石蜡包埋进行石蜡切片。取厚5 μm的横切面按厂家说明书对进行苏木素-伊红(HE)染色和尼氏(Nissl)染色。图像均采用光学显微镜(日本东京奥林巴斯)获得。HE染色后切片病理评分标准:0分=无损坏;1分=灰质中有1～5个嗜酸性神经元;2分=灰质中有6～10个嗜酸性神经元;3分=灰质中有10个以上嗜酸性神经元;4分=脑灰质梗死面积占1/3以内;5分=脑灰质梗死面积占1/3～1/2；6分=脑灰质梗死面积占1/2以上。Nissl染色计数每次观察3个视野。

1.4免疫荧光染色 伤后3 d取脊髓组织标本，收集包含病变部位的T7～T9脊髓段。所有脊髓用4%PFA固定，冲洗，石蜡包埋。切割厚度为5 μm的横切面，在二甲苯中脱蜡，并用乙醇洗涤重新水化。切片在室温下与10%正常山羊血清在含0.1%tritonx-100的磷酸盐缓冲液(PBS)中孵育1 h。然后将它们与适当的一级抗体在同一缓冲液中于4℃孵育过夜。一级抗体孵育后，将切片洗涤4×10 min，然后在室温下与Alexa Fluor 488/594山羊抗兔/鼠二级抗体孵育1 h。切片用PBS冲洗3次，并与4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育10 min，最后在PBS中洗涤并用盖玻片密封。荧光显微镜(日本东京奥林巴斯公司)对图像进行拍摄，对每只动物病变部位30～40个随机切片的进行计数。每组重复3次。

1.5Western印迹 伤后3 d，使用含有1 mmol/L PMSF的RIPA裂解缓冲液(Beyotime，中国上海)从脊髓提取总蛋白(收集包含病变部位的T7～T9脊髓段)，然后使用增强的BCA蛋白分析试剂盒(Beyotime，中国上海)使用微孔板读取器(分子器件Flexstation 3，美国)测量蛋白浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离40 ng组织蛋白并转移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad，California，USA)。用5%脱脂乳封闭2 h后，用抗酶切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved-caspase)-3(1∶500)、肿瘤坏死因子(TNF)-α(1∶200)、白细胞介素(IL)-1β(1∶500)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(1∶5 000)孵育细胞膜。然后，用3次TBS洗涤膜5 min，并用辣根过氧化物酶结合的二级抗体处理。用TBST洗涤3次后，用电化学发光加试剂(Invitrogen，Carlsbad，USA)观察印迹。每组重复3次。

1.6统计学方法 使用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1OE可促进SCI后的运动功能恢复 SCI组和SCI+OE组0、7、14、21、28 d BBB评分、斜面试验显著低于Sham组(P<0.05)。SCI+OE组14、21、28 d BBB评分、斜面试验显著高于SCI组(P<0.05)。见表1、2。与Sham组清晰足迹相比，SCI组后肢出现明显的拖拽(红色足迹)，而SCI+OE组显示出相当一致的后肢轨迹，几乎没有绊倒(图1)，其运动功能得到了明显的改善。

表1 各组不同时间BBB评分比较分)

表2 各组不同时间斜面试验比较

图1 各组运动功能

2.2OE可明显改善SCI引起的形态学改变 HE染色显示，SCI组神经元肿胀较对照相比明显加重；而SCI+OE组与SCI组相比其神经元肿胀程度明显减轻。Nissl染色显示，SCI组Nissl小体在胞质内聚集，与Sham组相比染色较深，而SCI+OE组染色明显较SCI组变浅。BBB评分及Nissl染色计数均显示SCI+OE组较SCI组脊髓损伤引起的形态学改变得到明显改善(P<0.01)。见图2、表3。

图2 OE可改善SCI引起的形态学改变

表3 BBB评分及Nissl染色细胞数

2.3OE可降低SCI引起的神经元炎症反应 与Sham组比较，星形胶质细胞激活的标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及小胶质细胞激活的标志物(Iba1)在SCI组中呈现明显高表达(P<0.001)；而SCI+OE组与SCI组相比以上两种标志物均明显减少(P<0.01)。见图3、表4。

图3 3组脊髓切片免疫荧光染色(×200)

表4 3组脊髓中GFAP及Iba1表达水平

2.4OE可通过抑制免疫炎症反应进而减轻神经元细胞过度凋亡 SCI组与Sham组相比，Cleaved-caspase-3、TNF-α、IL-1β(P<0.05)明显增加。SCI+OE组与SCI组相比，Cleaved-caspase-3、TNF-α及IL-1β明显下降(P<0.01)。见图4、图5、表5。

图4 OE可通过抑制免疫炎症反应进而减轻神经元细胞过度凋亡(免疫荧光染色，×200)

图5 各组Cleaved-caspase-3、TNF-α、IL-1β蛋白表达

表5 3组神经元细胞中Cleaved-caspase-3、 TNF-α及IL-1β蛋白表达

3 讨 论

SCI是一种严重的中枢神经系统疾病，据统计美国每年有 8 000～11 000例新发SCI患者〔13〕，其发病与炎症反应息息相关。

OE一种无毒的多酚类裂环烯醚萜苷类化合物〔14，15〕，其具有多种药理作用，已被广泛应用于临床各类疾病的治疗及预防中。在神经保护方面，其作用同样较为显著，Pantano等〔16〕的研究说明在 小鼠中添加OE和多酚类化合物可显著改善高脂血症小鼠的认知功能，表明OE对行为表现和神经病理学有一定的影响，可以产生类神经保护作用。另外OE具有不同程度的抗炎活性。一项动物实验研究表明OE可以通过抑制Toll样受体(TLR)和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号传导来减少炎症反应，并且可以用作抗炎药进行临床应用〔17〕；Horcajada等〔18〕的研究证明OE可明显减慢豚鼠自发性骨关节炎病变的进程，减少其免疫炎症反应，对骨关节具有重要的保护作用。

据报道，运动功能学测定在SCI的评估中具有明确的有效性和可靠性〔19〕。本研究结果发现OE可在一定程度上促进SCI大鼠运动功能的恢复；OE可改善大鼠神经元肿胀程度。

有研究表明胶质细胞的状态对SCI后运动功能的评估具有重要的意义和价值，其过度激活表明炎症反应的增强〔20〕。本研究结果说明SCI可引起神经元炎症反应，OE可改善SCI引起的神经元炎症过度激活状态；SCI可致神经元细胞凋亡增加，而OE可降低该凋亡现象，因此认为OE可通过抑制免疫炎症反应进而减轻神经元细胞过度凋亡，从而发挥其对SCI的保护作用，但其具体作用机制仍需进一步研究加以证实。