基于mTOR/S6K1信号通路研究下调miR-194-1对糖尿病肾病模型大鼠的干预作用

周密 杨丽 陈海滨 宋俊华 杨水生

(1长沙市第四医院内分泌科，湖南 长沙 410000；2湖南省人民医院)

糖尿病作为一种临床较为常见的慢性疾病，其发生发展会诱发一系列的并发症，严重威胁患者身体健康〔1〕。糖尿病肾病是较为常见的糖尿病并发症〔2，3〕，老年人群为糖尿病肾病主要发病群体，近年来，我国每年新增糖尿病肾病病例数连年上升〔4，5〕。糖尿病肾病临床治疗难度较高，有些患者可能会进一步发展为终末期肾脏病，对患者生命安全造成威胁〔6，7〕。目前临床医学尚无特效的治疗糖尿病肾病的手段，许多专家学者开始致力于糖尿病肾病新的治疗靶点的研究〔8～10〕。本研究建立糖尿病肾病大鼠模型，靶向调控微小RNA-194-1(miR-194-1)表达，观察效果。

1 材料与方法

1.1材料 选取40只SD健康雄性大鼠，由华兰生物工程股份有限公司提供，8～10月龄，平均(9.0±0.8)月龄；体重218～243 g，平均体重(232.5±6.7)g。在相对湿度50%～55%、温度(22.7±2.1)℃的环境中喂养1 w，光照12 h/d。主要试剂：大鼠抗小鼠miR-194-1抗体(Gibco公司)；小鼠抗大鼠血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)抗体(Dako公司)；大鼠抗小鼠过氧化氢酶(CAT)、终末氧化蛋白产物(AOPP)抗体(Selleck公司)；兔抗小鼠白细胞介素(IL)-6、IL-1β抗体(Sigma公司)；小鼠抗兔磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)抗体(Invitrogen公司)；小鼠抗兔磷酸化核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(p-S6K1)抗体(Hyclone公司)。

1.2方法

1.2.1建模及分组 随机选取10只大鼠为正常组，不做处理。其余30只建立糖尿病肾病模型：隔夜禁食16 h，对30只建模大鼠一次性腹腔注射60 mg/kg STZ。5 d后检测大鼠血糖，血糖>16.7 mmol/L、尿糖、尿蛋白阳性视为糖尿病肾病模型建立成功。共建模成功27只，将27只糖尿病肾病模型大鼠随机分为模型组、上调miR-194-1组、下调miR-194-1组各9只。下调miR-194-1组大鼠尾部静脉注射30 mg/kg antagomiR-194-1，上调miR-194-1组大鼠尾部静脉注射30 mg/kg agomiR-194-1，正常组、模型组大鼠尾部静脉注射等量生理盐水。

1.2.2空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平检测 取各组大鼠腹部静脉血3 ml，2 000 r/min离心处理15 min后分离上清液，在-80℃环境中保存待检。血糖检测仪检测FBG、HbA1c水平。CHOD-PAP法检测TC水平，GPO-PAP法检测TG水平，检测过程按照TC单试剂测定试剂盒、TG检测试剂盒操作说明书进行。

1.2.3miR-194-1表达检测 RT-PCR检测miR-194-1表达。Trizol法提取细胞总RNA，检测RNA纯度、含量，逆转录处理后获得cDNA，采用Primer 5.0软件设计引物序列，2-ΔΔCt方法计算miR-194-1表达，内参U6。

1.2.4肾重指数检测、肾组织苏木素-伊红(HE)染色 称量、记录各组大鼠体重，麻醉后颈椎脱臼法处死，取肾组织称重，对肾重指数进行计算。将大鼠肾组织固定在4%甲醛中，完全浸泡，1 d后常规石蜡包埋、切片。切片脱蜡、脱水处理后梯度酒精复水3 min，苏木素染色，清洗后分化、酒精脱水，伊红染色后再次梯度酒精脱水，封片后显微镜观察。

1.2.5酶联免疫吸附试验检测SCr、BUN、IL-6、IL-1β、CAT、AOPP水平 设定1空白孔、10标准孔，标本稀释后封板，37℃培养箱静置0.5 h后充分洗板，拍干后个孔添加50 μl酶标液(空白孔除外)，封膜孵育0.5 h后洗板，拍干后各孔添加50 μl显色A液、B液并摇晃均匀，室内遮光静置20 min，添加50 μl终止液，450 nm波长测吸光度，检测SCr、BUN、IL-6、IL-1β、CAT、AOPP水平。

1.2.6Western印迹检测p-mTOR、p-S6K1相对表达量 提取50 μg蛋白煮沸变性，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转膜、封闭(室内1.5 h)，添加一抗(1∶2 000)后孵育1 d，次日Western液充分清洗后添加二抗(1∶5 000)进行孵育，1 h后再次使用Western液清洗，显色、曝光、成像后检测条带灰度值，检测p-mTOR、p-S6K1相对表达量。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件行F检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1各组肾组织病理图HE染色 如图1所示，正常组肾组织细胞大小平均，形态规则；模型组、上调miR-194-1组肾组织细胞大小、形态均不规则，肾小球结构受损，且细胞排列较为杂乱；下调miR-194-1组肾组织细胞结构较为完整，细胞大小、形态较规则，细胞排列较为整齐。

图1 各组肾组织病理HE染色(×400)

2.2各组miR-194-1表达比较 如表1所示，与正常组比较，其他3组miR-194-1表达较高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组、上调miR-194-1组比较，下调miR-194-1组miR-194-1表达较低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3各组FBG、HbA1c、TC、TG水平比较 如表1所示，与正常组比较，其他3组FBG、HbA1c、TC、TG水平较高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组、上调miR-194-1组比较，下调miR-194-1组FBG、HbA1c、TC、TG水平较低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.4各组肾重指数、SCr、BUN水平比较 如表2所示，与正常组比较，其他3组肾重指数、SCr、BUN水平较高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组、上调miR-194-1组比较，下调miR-194-1组肾重指数、SCr、BUN水平较低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组miR-194-1表达及FBG、HbA1c、TC、TG水平比较

表2 各组肾重指数、SCr、BUN水平比较

2.5各组IL-6、IL-1β、CAT、AOPP水平比较 如表3所示，与正常组比较，其他3组IL-6、IL-1β、AOPP水平较高，CAT水平较低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组、上调miR-194-1组比较，下调miR-194-1组IL-6、IL-1β、AOPP水平较低，CAT水平较高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组IL-6、IL-1β、CAT、AOPP水平及p-mTOR、p-S6K1相对表达量比较

2.6各组p-mTOR、p-S6K1相对表达量比较 如表3、图2所示，与正常组比较，其他3组p-mTOR、p-S6K1相对表达量较高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组、上调miR-194-1组比较，下调miR-194-1组p-mTOR、p-S6K1相对表达量较低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

1～4：正常组、模型组、上调miR-194-1组、下调miR-194-1组图2 各组p-mTOR、p-S6K1表达

3 讨 论

微小RNA(miRNA)在大多数生物中大量存在，miR-194-1为miRNA家族的重要组成部分，在糖尿病肾病中呈现异常高表达〔11～13〕。糖尿病肾病发生主要原因为机体异常、持续的高血糖状态，并且其不断发展还会导致机体血脂水平异常〔14,15〕。本文研究结果说明，糖尿病肾病的发生发展伴随着血糖、血脂水平异常，下调miR-194-1表达能够有效抑制糖尿病肾病模型大鼠血糖、血脂水平，从而发挥干预效果。糖尿病肾病的发生发展会对机体肾功能造成严重的威胁〔16,17〕。SCr、BUN是临床常用的评价机体肾功能损伤状况的指标。彭静〔18〕通过动物实验表示，糖尿病肾病的发生发展会使动物模型肾重指数明显上升，造成较为严重的肾脏损伤。本文研究结果说明，糖尿病肾病的发生发展导致肾重指数上升及机体肾功能损伤，下调miR-194-1表达能够改善大鼠肾重指数，使糖尿病肾病大鼠肾功能得到有效提升。

糖尿病肾病的发生发展伴随着机体肾脏组织炎症反应、氧化应激反应〔19,20〕。IL-6、IL-1β是常用的评价机体炎症反应的指标，二者水平变化与机体炎症反应密切相关。CAT是机体防御系统汇总的重要酶类清除剂，能够清除过氧化氢，减轻细胞损伤。AOPP是常用的体现机体氧化应激反应严重程度的产物。本文研究结果说明，下调miR-194-1表达能够有效减轻糖尿病肾病大鼠肾脏组织炎症反应、氧化应激损伤严重程度，从而起到肾脏保护作用。

有研究表示，mTOR/S6K1信号通路在糖尿病肾病发生发展过程中起到重要作用〔21〕。mTOR/S6K1通路蛋白表达变化与机体肾组织细胞损伤、自噬具有密切联系，本文研究结果显示，糖尿病肾病模型大鼠p-mTOR、p-S6K1表达较高，下调miR-194-1表达的糖尿病肾病大鼠p-mTOR、p-S6K1表达下调，可能是因为下调miR-194-1表达能够靶向调控mTOR/S6K1信号通路，抑制p-mTOR、p-S6K1表达，从而起到改善糖尿病肾病大鼠肾组织细胞自噬活性、减轻肾组织损伤的作用。

综上所述，下调糖尿病肾病模型大鼠miR-194-1表达，能够改善大鼠血糖、血脂水平，改善糖尿病肾病模型大鼠肾脏病变状况及肾功能，减轻炎症反应、氧化应激损伤严重程度，发挥肾脏保护作用，出现这一干预效果可能是由于下调miR-194-1表达能够靶向调控mTOR/S6K1信号通路，从而起到减轻肾组织损伤的作用，为糖尿病肾病的临床治疗提供了新的研究方向。