黄连解毒汤通过抑制ApoE-/-小鼠巨噬细胞极化和炎症减轻高脂饮食诱导的动脉粥样硬化

何金涛 轩弘源 罗舒文 吴琼 俞琦 田维毅

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

近年来，中国心血管疾病(CVD)患病率和死亡率呈现逐年上升的趋势〔1〕。动脉粥样硬化(AS)被认为是一种慢性炎症性疾病，是引发CVD常见的病理基础〔2〕。巨噬细胞(Macrophage)可通过吞噬(胞吞)、增殖、迁移和分泌促炎因子等方式参与AS发生、发展及最后斑块破裂的整个过程，并起着关键作用〔3，4〕。研究表明，调控巨噬细胞极化方向，可能是干预AS的一种有效途径〔5〕。中药在AS治疗中具有巨大的潜质，运用中药抑制巨噬细胞向M1型极化、促进向M2型极化，表现出了较强的抗炎性并能增加AS斑块的稳定性〔6〕。黄连解毒汤(HLJDD)为经典的中药复方，记载于《外台秘要》，由黄连、黄芩、黄柏和栀子四位中药组成，具有清三焦火热，解毒的功效。现代药理学研究发现其具有抗炎、降脂的作用，并能抑制AS进展〔7〕。本研究通过观察HLJDD对载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠AS模型主动脉病理、血清炎症因子及巨噬细胞极化标记物CD197、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和CD206表达的影响，探讨其通过抑制巨噬细胞极化和炎症发挥抗AS作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与药材 8周龄SPF级雄性ApoE-/-小鼠，体重18～22 g，购于北京大学医学部实验动物中心，许可证号：SCXK(京)〔2016-0010〕。中药饮片黄连、黄芩、黄柏、栀子一次性购于北京同仁堂贵阳分店，经贵州中医药大学生药教研室专家鉴定为正品。

1.1.2主要试剂与仪器 总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒购自中生北控生物科技有限公司；超敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-4和IL-10酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、iNOS抗体、CD197山羊多克隆抗体、CD206兔多克隆抗体、驴抗山羊免疫球蛋白(Ig)G二抗和山羊抗兔IgG二抗购自英国Abcam公司；苏木素染液、油红O染液购自美国Sigma公司；FC型酶标仪、-80℃超低温冰箱、高速冷冻离心机购自Thermo公司；AU480型全自动生化分析仪购自美国Beckman Coulter公司。

1.2方法

1.2.1制备HLJDD水煎液 黄连解毒汤按原方配伍比例3∶2∶2∶3(即黄连9 g、黄芩6 g、黄柏6 g、栀子 9 g )进行常规方法配制。调至浓度为2 g/ml，放置于4℃冰箱备用，每周制备一次。

1.2.2动物 AS模型建立〔8〕ApoE-/-小鼠24只，适应性喂养1 w后开始给予含脂肪37%、蛋白质19.7%、碳水化合物43.3%的灭菌(西方膳食型)高脂饲料饮食造模。另设同周龄野生型C57BL/6J小鼠6只为正常(Control)组，给予普通饲料。造模12 w，确定AS成模后，将AS模型小鼠随机分为模型(Model)组、黄连解毒汤高剂量(HLJDD-H)组、黄连解毒汤低剂量(HLJDD-L)组，每组6只，HLJDD-H、HLJDD-L给药剂量分别为10 g/(kg·d)、2.5 g/(kg·d)，给药体积为0.1 ml/10 g，正常组和模型组给予同体积生理盐水，灌胃6 w，每日1次。

1.2.3血清及主动脉标本采集 给药结束后禁食不禁水12 h，摘眼球取血，常温静置2 h，3 000 r/min离心10 min，分离血清后-20℃冰箱保存，用于生化指标检测。无菌条件下取心脏及主动脉，一部分存放于10%中性甲醛溶液固定，另一部分液氮速冻，置于-80℃冰箱备用。取材过程符合实验动物伦理学要求。

1.2.4血脂检测 采用全自动生化分析仪检测各组小鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量。

1.2.5主动脉苏木素-伊红(HE)染色 从10%中性甲醛中取出心脏及主动脉根部石蜡包埋，进行常规HE染色，光学显微镜下观察主动脉病理变化并拍照保存。

1.2.6主动脉油红O染色 将主动脉根部进行横切制作冰冻切片，进行常规油红O染色，拍照并用Image Pro Plus软件对斑块面积进行分析。

1.2.7免疫荧光染色 将主动脉放入多聚甲醛20 min，室温下通透组织切片20 min，3%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1 h，按1∶100滴加iNOS和CD206抗体，4℃过夜，按1∶2 000滴加二抗，室温1 h，按1∶7 000滴加4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)，染色15 min。封片，荧光显微镜下观察并拍照记录并用Image pro plus软件进行分析。

1.2.8免疫组化染色(IH) 将主动脉依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，梯度酒精各3 min，蒸馏水浸洗2 min。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，修复抗原。3%过氧化氢溶液避光孵育20 min。加一抗孵育15 h，加二抗孵育50 min。加二氨基联苯胺(DAB)显色液，阳性信号显示为棕色，苏木素复染3 min，氨水返蓝。依次放入梯度酒精、无水乙醇、二甲苯进行脱水。封片，光学显微镜下观察、拍照并用Image Pro Plus软件进行指标分析。

1.2.9血清指标检测 采用ELISA检测各组小鼠血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-4和IL-10含量，严格依照试剂盒说明书进行操作。

1.3统计学处理 采用SPSS17.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1HLJDD对各组血脂水平的影响 与Control组比较，Model组TC、TG和LDL-C水平均显著升高，HDL-C显著降低(P<0.01)。与Model组相比，HLJDD-H和HLJDD-L组TC、TG、和LDL-C水平均明显降低，HDL-C显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组血清中TC、TG、LDL-C、HDL-Chs-CRP、TNF-α及IL-6水平比较

2.2HLJDD对各组血清中炎症因子水平的影响 与Control组比较，Model组hs-CRP、TNF-α和IL-6水平均明显升高，IL-4、IL-10水平明显降低(P<0.01)。与Model组相比较，HLJDD-H和HLJDD-L组hs-CRP、TNF-α和IL-6水平均明显降低(P<0.05，P<0.01)，IL-4、IL-10水平均明显升高(P<0.05)。见表1、表2。

2.3HE染色观察主动脉病理形态 与Control组比较，Model组主动脉内膜大面积增厚，形成明显的泡沫细胞，部分区域出现特征性的AS斑块。与Model组比较，HLJDD-H和HLJDD-L组主动脉斑块及血管壁泡沫细胞明显减少。其中，HLJDD-H组比HLJDD-L组显效更为明显。见图1。

表2 各组血清中IL-4、IL-10水平比较

图1 HE染色观察各组主动脉病理变化(×40)

2.4油红O染色观察AS斑块 与Control组比较，Model组主动脉存在大面积斑块，且分布大量脂滴。与Model组比较，HLJDD-H和HLJDD-L组主动脉斑块面积和脂滴都明显减少，HLJDD-H组比HLJDD-L组减少更为明显。见图2。

2.5免疫荧光染色观察HLJDD对主动脉巨噬细胞iNOS、CD206表达的影响 与Control组比较，Model组M1型极化标志物iNOS表达量明显升高，M2型极化标志物CD206表达量显著降低(P<0.01)。与Model组比较，HLJDD-H和HLJDD-L组iNOS表达明显降低，CD206表达显著升高(P<0.01)。HLJDD-H组影响更明显。见表3、图3、图4。

图2 油红O染色观察各组AS斑块(×40)

表3 各组主动脉壁iNOS、CD206水平、主动脉CD197、CD206阳性表达率比较

图3 免疫荧光观察各组主动脉斑块iNOS表达量的变化(×200)

2.6免疫组化观察主动脉CD197、CD206分子表达 阳性细胞显色为棕色，蓝色为细胞核。与Model组相比，HLJDD-H和HLJDD-L组CD197明显减少，CD206明显增多(P<0.01，P<0.05)。见表3、图5、图6。

图4 免疫荧光观察各组主动脉斑块CD206表达量的变化(×200)

图5 免疫组化观察各组主动脉CD197 变化(×400)

图6 免疫组化观察各组主动脉CD206 变化(×400)

3 讨 论

AS属于一种动脉壁慢性炎症性疾病〔9〕，炎症反应在AS中扮演着重要角色。AS形成过程主要以脂质和炎症细胞积累导致坏死性巨噬细胞和泡沫细胞积聚为特征〔10〕，活化的巨噬细胞通过炎症机制在AS中发挥重要作用〔11〕。巨噬细胞广泛参与免疫系统调节，具有较强的可塑性，根据极化后功能表现被分为M1型和M2型。经典的M1型巨噬细胞具有促炎作用，极化的M2型巨噬细胞具有抗炎作用〔12〕。大量聚集的内源性脂质被氧化成氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，可诱导趋炎性因子，如γ-干扰素(IFN-γ)、TNF-α、CRP等，激活单核细胞或巨噬细胞向经典的M1型巨噬细胞极化，并分泌活性氧(ROS)、iNOS和IL-6等发挥促炎活性。IL-4则激活巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化，并分泌抗炎因子IL-10发挥抗炎活性，能够起到组织修复和稳定AS斑块作用〔10〕。因此，如何抑制巨噬细胞向M1型极化，促使向M2型分化将是控制炎症和AS发展的关键。

近年来，中草药在AS的治疗中表现出了多效应、多靶点和多途径的优势。中医认为AS的病机多为“热邪”与“毒邪”蕴积。HLJDD作为清热解毒类代表方剂，具有清泻三焦之火，清热解毒的功效，方中黄连、黄芩、黄柏、栀子按君、臣、佐、使合理配伍，使清解上中下三焦火热毒邪之力更强。现代药理学研究发现，组方中的有效成分黄芩苷、小檗碱、栀子苷等具有抗炎、抗氧化、调脂、保护内皮细胞、稳定斑块的作用〔7，13〕。同时，实验研究也发现，HLJDD确有调控炎症反应，干预AS的作用〔14〕。目前，HLJDD在临床炎症性疾病中得到较多应用并显示出了良好的治疗效果。

本研究结果证实，HLJDD确有抗AS作用。iNOS在M1型巨噬细胞中出现高表达，能够损伤内皮细胞，促使炎症进一步发展及AS斑块的形成〔15〕，CD206作为M2型巨噬细胞极化的重要标志，其水平升高提示巨噬细胞产生了抑炎作用来调节AS炎症发展。因此，本研究推测，HLJDD抗AS作用可能与其促进巨噬细胞向M2型极化，抑制M1型极化有关。与课题组前期研究一致〔16，17〕，本研究结果也显示，HLJDD发挥抗炎、抗AS作用存在一定的量效关系。本研究将为清热解毒类方药应用于抗AS及相关炎症性疾病积累科学依据。