circ_0057421/miR-576-5p对MIA诱导的骨关节炎软骨细胞凋亡及氧化应激的影响

戴政文 杨志新 欧阳建军 何伟

(湖北省中医院 湖北中医药大学附属医院 湖北省中医药研究院骨科，湖北 武汉 430070)

骨关节炎是临床常见的一种退行性关节疾病，目前骨关节炎发病机制尚未阐明，已知蛋白聚糖减少可引起软骨基质合成及降解从而破坏软骨组织，软骨细胞损伤是促进骨关节炎发生及发展的重要原因之一，因而阐明骨关节炎的发病机制对骨关节炎的治疗具有重要作用〔1〕。环状RNA(circRNA)广泛存在于动植物体内，并可参与骨关节炎发生及发展过程，circSERPINE2通过靶向miR-1271而预防骨关节炎〔2〕。circRNA-9119通过miR-26a/PTEN轴可减轻白细胞介素(IL)-1β诱导的软骨细胞损伤〔3〕。circRNA-UBE2G1通过miR-373/HIF-1α轴调控脂多糖(LPS)诱导的骨关节炎〔4〕。circ_0057421在骨关节炎组织中表达上调，但关于其作用机制尚未阐明〔5〕。靶基因预测显示miR-576-5p与circ_0057421存在结合位点，miR-576-5p骨关节炎组织中表达下调〔6〕。但circ_0057421/miR-576-5p对软骨细胞损伤的作用机制尚未可知。因此，本研究采用碘乙酸钠(MIA)诱导软骨细胞建立骨关节炎软骨细胞损伤模型，探讨circ_0057421/miR-576-5p对MIA诱导的骨关节炎软骨细胞凋亡、骨关节炎标志物及氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 2017年3月至2019年2月于湖北省中医院收治的30例骨关节炎的患者，其中男18例，女12例，年龄53～62岁，平均(58.63±6.39)岁，患者符合国际软骨修复协会分级标准且均为Ⅰ级损伤。排除标准：化脓性关节炎患者。随机收集湖北省中医院急诊外科收治的30例紧急创伤性截肢患者的正常软骨标本，其中男20例，女10例，年龄50～65岁，平均(55.35±5.59)岁。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者知情且签署同意书。

人软骨细胞CHON-001(ATCC细胞库)；MIA(美国Sigma-Aldrich公司)；DMEM培养液、胎牛血清(美国Gibco公司)；RNA提取试剂、凋亡检测试剂(美国Sigma公司)；反转录与荧光定量PCR检测试剂(大连宝生物公司)；丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂(南京建成生物工程研究所)；兔抗人B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体(美国Santa Cruz公司)；兔抗人胶原蛋白(Collagen)Ⅱ抗体(美国Abcam公司)；兔抗人性别决定区Y框蛋白(SOX)9抗体(广州佰汇生物科技有限公司)；兔抗人基质金属蛋白酶(MMP)1、MMP13抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(武汉艾美捷科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1实验分组 软骨细胞培养于含4 μmol/L MIA的培养液培养48 h〔7〕，记为MIA组。同时将正常培养的细胞记为NC组。si-con、si-circ_0057421、miR-con、miR-576-5p mimics、si-circ_0057421与anti-miR-con、si-circ_0057421与anti-miR-576-5p转染入软骨细胞后加入含4 μmol /L MIA的培养液培养48 h，分别记为si-con组、si-circ_0057421组、miR-con组、miR-576-5p组、si-circ_0057421+ anti-miR-con组、si-circ_0057421+ anti-miR-576-5p组。

1.2.2qRT-PCR检测circ_0057421、miR-576-5p的表达水平 采用Trizol法提取正常软骨组织、骨关节炎软骨细胞组织及各组软骨细胞总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度与纯度后置于-80℃超低温冰箱内保存。反转录体系：5×gDNA缓冲液2 μl，10×King RT缓冲液2 μl，FastKing RT Enzyme Mix 1 μl，FQ-RT Primer Mix 2 μl，RNA(2 μg)，RNase-Free ddH2O补足体系至20 μl；反应条件：42℃ 15 min，95℃ 3 min。cDNA稀释20倍后进行qRT-PCR，反应程序及反应条件均按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡率 各组软骨细胞中加入预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后弃上清，向细胞沉淀中加入500 μl结合缓冲液重悬细胞，依次分别加入5 μl膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)、5 μl碘化丙啶(PI)，室温振荡孵育10 min后应用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4检测MDA、LDH、SOD、GSH-Px的含量 收集各组细胞培养上清液，根据试剂盒说明书分别检测MDA、LDH、SOD、GSH-Px的含量。

1.2.5双荧光素酶报告基因检测circ_0057421与miR-576-5p的靶向关系 Circular RNA Interactome预测显示circ_0057421与miR-576-5p存在靶向关系，将结合位点与突变位点分别克隆至pmirGLO载体得到野生型载体WT-circ_0057421、突变型载体MUT-circ_0057421，miR-con、miR-576-5p mimics分别与WT-circ_0057421、MUT-circ_0057421共转染入软骨细胞，继续培养48 h后收集细胞并检测相对荧光素酶活性。

1.2.6Western印迹检测Bcl-2、CollagenⅡ、SOX9、Bax、MMP1、MMP13蛋白表达 各组软骨细胞中加入 RIPA裂解液(500 μl)提取细胞总蛋白后加入5×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液，沸水煮10 min后蛋白变性，取40 μg蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，将分离的蛋白凝胶转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温孵育2 h后加入一抗稀释液(1∶1 000)，4℃孵育24 h，使用TBST洗涤后加入二抗稀释液(1∶2 000)后室温孵育1 h，滴加ECL后显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1circ_0057421和miR-576-5p在骨关节炎组织中的表达 与正常软骨组织比较，骨关节炎软骨组织中circ_0057421表达水平明显升高，miR-576-5p表达水平明显降低(P<0.05)，见表1。与NC组比较，MIA组circ_0057421表达水平明显升高，miR-576-5p表达水平明显降低(P<0.05)，见表2。

表1 circ_0057421和miR-576-5p在骨关节炎软骨组织和 细胞中的表达

表2 circ_0057421和miR-576-5p在骨关节炎 软骨细胞中的表达

2.2敲低circ_0057421对骨关节炎软骨细胞凋亡、骨关节炎标志物及氧化应激的影响 与si-con组比较，si-circ_0057421组MDA、LDH含量明显降低，SOD、GSH-Px含量明显升高，凋亡率明显降低，Bcl-2、CollagenⅡ、SOX9蛋白水平明显升高，Bax、MMP1、MMP13蛋白水平明显降低(P<0.01，P<0.001)，见图1、图2、表3。

2.3circ_0057421与miR-576-5p相互作用 Circular RNA Interactome预测显示circ_0057421与miR-576-5p存在结合位点，见图3。miR-576-5p过表达可降低野生型载体WT-circ_0057421的荧光素酶活性(P<0.05)，而对突变型载体MUT-circ_0057421的荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)，见表4。

图1 敲低circ-8057421对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

1，2：si-con组、si-circ_0057421组图2 敲低circ_8057421对骨关节炎标志物相关 蛋白表达的影响

表3 敲低circ_0057421对骨关节炎软骨细胞凋亡、氧化应激、骨关节炎标志物相关蛋白表达的影响

图3 circ_0057421与miR-576-5p存在互补核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

2.4circ_0057421调控miR-576-5p在骨关节炎软骨细胞系中的表达 与pcDNA组比较，pcDNA-circ_0057421组circ_0057421表达水平明显升高，miR-576-5p表达水平明显降低(P<0.05)；与si-con组比较，si-circ_0057421组circ_0057421表达水平明显降低，miR-576-5p表达水平明显升高(P<0.05)，见表5。

2.5miR-576-5p过表达对骨关节炎软骨细胞凋亡、骨关节炎标志物及氧化应激的影响 与miR-con组比较，miR-576-5p组MDA、LDH含量明显降低，SOD、GSH-Px含量明显升高，凋亡率明显降低，Bcl-2、CollagenⅡ、SOX9蛋白水平明显升高，Bax、MMP1、MMP13蛋白水平明显降低(P<0.01,P<0.001)，见表6、图4、5。

表5 circ_0057421调控miR-576-5p在骨关节炎软骨 细胞系中的表达

表6 miR-576-5p过表达对骨关节炎软骨细胞凋亡、氧化应激、骨关节炎标志物相关蛋白表达的影响

图4 miR-576-5p过表达对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

图5 miR-576-5p过表达对骨关节炎标志物 相关蛋白表达的影响

2.6敲低miR-576-5p逆转抑制circ_0057421对骨关节炎软骨细胞凋亡、骨关节炎标志物及氧化应激的影响 与si-circ_0057421+ anti-miR-con组比较，si-circ_0057421+ anti-miR-576-5p组MDA、LDH含量明显升高，SOD、GSH-Px含量明显降低，凋亡率明显升高，Bcl-2、CollagenⅡ、SOX9蛋白水平明显降低，Bax、MMP1、MMP13蛋白水平明显升高(P<0.05)，见图6、表7、图7。

1，2:si-circ_0057421+anti-miR-con组、si-circ_0057421+ anti-miR-576-5p组,图7同图6 敲低miR-576-5p逆转抑制circ_0057421对 骨关节炎标志物相关蛋白表达的影响

表7 敲低miR-576-5p逆转抑制circ_0057421对骨关节炎软骨细胞凋亡、氧化应激、骨关节炎标志物相关 蛋白表达的影响

图7 敲低miR-576-5p逆转抑制circ_0057421对 骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

3 讨 论

细胞外基质损伤是促进骨关节炎发展的重要原因之一，circRNA在骨关节炎软骨细胞损伤中可发挥重要调控作用，并可能作为诊断及治疗的潜在靶点，circ_0005105上调miR-26a，上调NAMPT表达并促进软骨细胞细胞外基质降解〔8〕。circ_0045714通过调控miR-193b/IGF1R而调节软骨细胞的增殖、凋亡和细胞外基质的合成〔9〕。circPSM3通过靶向miRNA-296-5p抑制骨关节炎软骨细胞的增殖和分化〔10〕。circTMBIM6通过miR-27a/MMP13轴促进骨关节炎诱导的软骨细胞胞外基质降解〔11〕。但仍有部分circRNA在骨关节炎软骨细胞损伤中的作用机制尚未阐明。

circ_0057421在骨关节炎软骨细胞损伤中的作用机制尚未阐明。本研究结果提示，circ_0057421在骨关节炎软骨细胞损伤中可能发挥重要调控作用。氧化应激可参与骨关节炎的发展过程，SOD、GSH-Px属于抗氧化酶，其可清除氧自由基，MDA属于脂膜氧化的产物，软骨细胞损伤时LDH的活性明显升高〔12,13〕。本研究结果提示，敲低circ_0057421可抑制MIA诱导的软骨细胞氧化应激。氧化应激可引起细胞凋亡，Bcl-2属于抗凋亡蛋白，Bax属于促凋亡蛋白，其水平升高可激活线粒体途径从而诱导细胞凋亡〔14〕。本研究结果提示，敲低circ_0057421可抑制MIA诱导的软骨细胞凋亡。MMP1、MMP13与关节软骨细胞损伤密切相关，CollagenⅡ、SOX9等表达水平降低是导致细胞外基质受损的重要原因〔15,16〕。本研究结果提示，敲低circ_0057421能够通过抑制基质金属蛋白酶分泌及促进CollagenⅡ、SOX9合成从而增强骨关节炎软骨细胞生长。

本研究证实，circ_0057421能够充当miR-576-5p的海绵分子，并可负向调控miR-576-5p的表达及活性。miR-576-5p在食道癌、子痫前期中表达异常并可参与多种疾病发生及发展过程〔17，18〕。本研究结果提示，circ_0057421可能通过负向调控miR-576-5p而参与骨关节炎发生过程。同时，本研究结果提示抑制miR-576-5p可明显逆转敲低circ_0057421对MIA诱导的软骨细胞凋亡、氧化应激的作用。