基于PI3K/Akt信号通路探究电针对带状疱疹后遗神经痛大鼠神经功能的干预机制

陈可 武彩花 郑俊 詹志丹

(1武汉市中西医结合医院针灸科,湖北 武汉 430033;2湖北日报传媒集团卫生所)

带状疱疹后遗神经痛为带状疱疹较常见的并发症，属于顽固性神经病理性疼痛疾病，主要症状多为自发痛、诱发痛、痛觉过敏等，病程大多迁延反复，临床治疗难度较大，在一定程度上影响患者的日常生活和工作〔1〕。目前随着临床上对带状疱疹后遗神经痛的不断研究发现，常规西医治疗效果不理想，多数研究致力于中医针灸治疗，电针已经用于此病的治疗，但并未有研究明确其作用机制〔2〕。报道显示，神经痛的发生与多信号转导通路相关，其中研究最为广泛的为磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路，此通路可介导周围神经系统痛觉过敏，诱发并维持神经痛〔3〕。基于上述背景，在本文研究中旨在分析电针对带状疱疹后遗神经痛大鼠脊髓神经功能PI3K/Akt信号通路的影响，明确电针治疗带状疱疹后遗神经痛的机制，为临床上电针在此病中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料 选取60只SFP级雄性大鼠，购自冠科生物技术(中山)有限公司，动物许可证号：SYXK(粤)2020-0240，6～8周龄，体质量200～250 g，在相对湿度为30%～35%、温度为(23.8±1.5)℃下饲养 7d，每日光照24 h，明暗周期为12 h。本次试验操作均严格参照动物实验伦理要求相关规定进行，且获得医院伦理委员会审批同意。

主要仪器及试剂：CV-1细胞(美国Invitrogen公司)，水痘带状疱疹病毒(西安市疾病控制中心)，Von Frey型电子测痛仪(美国Stoelting公司)，BME-410A型热痛刺激仪(中国医学科学院生物医学工程研究所)，穴位刺激仪(南京济生医疗科技有限公司)，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒、兔抗人p-PI3k抗体、小鼠大鼠p-Akt抗体(艾美捷科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1分组及建模 将所购买的60只大鼠随机分为A、B、C、D组各15只，A组不做任何处理，正常喂养，B、C、D组均参照Zhang等〔4〕研究建立带状疱疹后遗神经痛大鼠模型，将CV-1细胞加入至DMEM/F12完全培养基中制备成为细胞悬液，以5.0×104/cm2的浓度接种在培养瓶中，之后使用水痘带状疱疹病毒感染CV-1细胞，当80%的CV-1细胞被感染后收集并制备细胞悬液，行水痘带状疱疹病毒接种，将50 μl病毒注射于大鼠右足蹼底部，4 d后测定机械痛敏阈值、热痛敏阈值，降低表示建模成功。

1.2.2机械痛敏阈值、热痛敏阈值测定 在B、C、D组大鼠感染4 d后，分别对四组大鼠做机械痛敏阈值、热痛敏阈值测定，使用美国Stoelting公司Von Frey型电子测痛仪测定机械痛敏阈值，使用中国医学科学院生物医学工程研究所BME-410A型热痛刺激仪测定热痛敏阈值，以判定B、C、D组是否建模成功，最终B、C、D组大鼠均建模成功，行后续研究。

1.2.3干预 A组不做任何处理，进行正常喂养；B组使用生理盐水灌胃；C组使用27 mg/(kg·d)的普瑞巴林灌胃，1次/d，干预1 w；D组行电针干预。皮肤局部消毒，采用一次性无菌针灸针(0.18 mm×25.00 mm)刺入大鼠夹脊、局部阿是、心俞、胆俞，连接穴位刺激仪，施用不同频率(2～15 Hz)，进行约30 min刺激，其刺激深度大约为4.00 mm，0.5 h后出针，1次/d，干预1 w。

1.2.4机械痛敏阈值、热痛敏阈值测定 在上述干预结束后次日测定四组大鼠机械痛敏阈值、热痛敏阈值。

1.2.5样本采集 在机械痛敏阈值、热痛敏阈值测定完成后参照动物实验伦理要求相关规定对大鼠行麻醉后处死，迅速取脊髓组织，均匀分为4等份，其中1等份做脊髓组织悬液，2等份做组织切片，1等份在液氮中保存备用。

1.2.6脊髓组织神经递质测定 采用脊髓组织中神经递质P物质(SP)、神经激肽(NK)-1评价大鼠脊髓神经功能，取所制备的脊髓组织悬液，采用ELISA测定，将ELISA检测试剂盒放置于室温下做平衡20 min处理，之后将不同浓度的50 μl标准品加入至标准孔中，将50 μl待测样品加入至样本孔中，每孔中加入100 μl的辣根过氧化物酶标记的检测抗体，密封反应孔，在温度为37℃的环境下孵育1 h，将上清液弃除后加入350 μl洗涤液，在室温环境下孵育1 min，弃除上清液，重复上述步骤5次，之后将50 μl底物A、底物B加入至每孔中，37℃孵育15 min，之后终止反应，获得SP、NK-1水平。

1.2.7脊髓神经元形态变化检测 取脊髓组织切片，做苏木素-伊红(HE)染色，观察各组大鼠脊髓神经元形态变化。

1.2.8脊髓神经元凋亡检测 取脊髓组织切片，采用TUNEL染色法测定大鼠脊髓神经元凋亡情况。

1.2.9PI3K/Akt信号通路检测 取液氮中保存的脊髓组织，采用Western印迹法测定大鼠脊髓组织PI3K/Akt信号通路蛋白表达量，提取组织总蛋白，取20 μg蛋白质样本，电泳1.5 h后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在室温下做封闭处理，之后分别加入1∶1 000 Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)给予稀释的PI3K/Akt信号通路蛋白p-PI3k、p-Akt一抗，使用1∶2 500的辣根过氧化氢酶标记的二抗在室温下孵育处理，电化学发光(ECL)法显色，使用Labwork凝胶图像扫描所获得胶片，以磷酸甘油醛脱氧酶(GAPDH)为内参，计算p-PI3k、p-Akt蛋白表达量。

1.3统计学处理 采用SPSS25.0软件进行levene法检测、shapiro-wilk检验、方差分析、方差齐性检验及t检验。

2 结 果

2.1模型是否建立成功鉴定 B、C、D组机械痛敏阈值、热痛敏阈值显著低于A组(P<0.05)，说明模型建立成功。见表1。

2.2干预结束后各组机械痛敏阈值、热痛敏阈值对比 B、C、D组机械痛敏阈值、热痛敏阈值显著低于A组(P<0.05)；D组机械痛敏阈值、热痛敏阈值显著高于B、C组(P<0.05)。见表1。

2.3干预结束后各组脊髓组织神经递质对比 B、C、D组SP、NK-1显著高于A组(P<0.05)；D组SP、NK-1显著低于B、C组(P<0.05)。见表1。

2.4干预结束后各组脊髓神经元形态变化分析 A组脊髓神经元形态正常。B组脊髓神经元坏死，细胞碎片增多，细胞肿胀。C、D组较B组脊髓神经元细胞肿胀数减少，出现正常神经细胞，神经元坏死被修复，D组改善更为显著。见图1。

表1 各组干预前后机械痛敏阈值、热痛敏阈值、脊髓组织神经递质、脊髓神经元凋亡、脊髓组织PI3K/Akt 信号通路蛋白表达量对比

图1 干预结束后各组脊髓神经元形态(HE,×400)

2.5干预结束后各组脊髓神经元凋亡情况对比 B、C、D组凋亡指数显著高于A组(P<0.05)；D组凋亡指数显著低于B、C组(P<0.05)。见表1。

2.6干预结束后各组脊髓组织PI3K/Akt信号通路蛋白表达量对比 B、C、D组p-PI3k、p-Akt蛋白表达量显著高于A组(P<0.05)；D组p-PI3k、p-Akt蛋白表达量显著低于B、C组(P<0.05)。见表1、图2。

图2 各组PI3K/Akt信号通路蛋白

3 讨 论

带状疱疹后遗神经痛属于一种与脊髓、脊髓上中枢、外住神经敏化相关的神经疼痛，此病多发于老年人群，目前临床上多采用镇痛药物进行治疗，但效果并不理想，且长期用药多伴随着不同程度的不良反应〔5,6〕。

中医学上将带状疱疹后遗神经痛归于“蛇串疮”“缠腰火丹”等范畴，认为此病的病因多为内伤情志、肝郁气滞、正气不足、邪毒外感等所致，不通则痛〔7〕。中医认为针灸可用于治疗此病，认为经针刺对应穴位，发挥温通经脉、促使血气运行，血气运行则可发挥其通而不痛的作用，电针属于针灸的一种，用于治疗此病有效〔8,9〕。研究显示，针刺夹脊穴可调节督脉、足太阳经脉、全身的阳气，达到调节脏腑经络的作用〔10〕。目前临床上已有多数研究将电针应用于带状疱疹后遗神经痛的治疗中〔11,12〕，且已经取得了良好的成效，但并未有研究明确其具体作用机制，本研究结果显示，经电针干预的大鼠疼痛明显减轻，疼痛阈值提高，提示电针治疗有效。

研究显示，PI3K/Akt信号通路可介导痛觉过敏，参与神经痛的中枢敏化，在机体处于正常状态下时其在细胞、组织中的含量较少，但在外界信号的刺激下PI3K/Akt信号通路被激活，PI3k、Akt蛋白含量明显增多，可介导痛觉的产生〔13～15〕。目前临床上关于PI3K/Akt信号通路与神经痛的研究较少，周学龙等〔16〕在其研究中认为PI3K/Akt信号转导通路可经EphB受体介导大鼠神经病理性痛，另外陈欢等〔17〕在其研究中认为紫杉醇所诱发的神经痛与PI3K/Akt信号转导通路相关。目前临床上多采用神经递质含量评估神经功能，包括SP、NK-1等，其中SP具有双重作用，其一方面可产生疼痛，另一方面可传递痛觉信息，参与信号转导，而NK-1与SP密切相关，SP可经作用于带状疱疹后遗神经痛脊髓NK-1受体，在神经刺激下，两者相结合，共同传递痛觉信息，在带状疱疹后遗神经痛中发挥着重要的作用〔18～20〕。本文进一步分析电针有效减轻带状疱疹后遗神经痛大鼠疼痛的作用机制，分析大鼠脊髓神经递质、神经元及PI3K/Akt信号通路变化，结果显示，电针干预的大鼠脊髓组织中神经递质表达异常情况明显改善，神经元形态恢复正常，PI3K/Akt信号通路被抑制。这一结果显示，电针可能经调控PI3K/Akt信号通路，作用于脊髓神经功能，改善神经递质异常表达，减少神经元凋亡，而提高疼痛阈值。虽然本文上述结果显示，电针与带状疱疹后遗神经痛大鼠脊髓神经功能、PI3K/Akt信号通路相关，但目前并未有研究显示上述关系，且本次研究动物数量较少，因此本文上述结果还需后续研究进一步分析证实，以明确电针治疗带状疱疹后遗神经痛的作用机制。