SSEA-4在不同分期卵巢腺癌中表达及与化疗耐药和预后相关性

刘忠杰 宋永祯 王菲 范凤霞 王静 赵宁 毕凤玲 李桂芬

(衡水市人民医院 1妇科，河北 衡水 053000；2体检科；3衡水市第五人民医院妇产科)

卵巢癌(EOC)早期患者可达到90%的5年生存率，晚期发生转移的EOC患者仅29%生存率〔1,2〕。同时因该病具有早期症状不明显等特点且卵巢位于盆腔深部，故70%EOC患者确诊即为晚期，因此EOC具有占妇科恶性肿瘤首位的病死率，对女性健康具有严重威胁〔3,4〕。近10年随着手术治疗联合化疗治疗方案的应用，死亡率并未得到显著改善，多药耐药性是其中一项重要原因。研究表明约25%的卵巢腺癌患者发生原发性耐药，75%发展继发性耐药，因此寻找卵巢腺癌耐药性的特异性生物指标是急需解决的问题〔5,6〕。且EOC的发生发展受多基因共同决定，其的病情评估、早期筛查及预后判断亦需要较灵敏的肿瘤标记物。阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-4是存在于胚胎干细胞(ESCs)及内细胞群细胞(INC)表面〔7〕，多糖抗原的一种，可作为未分化细胞的表面标志〔8〕，近年来多研究表明乳腺癌等恶性肿瘤的发生发展与SSEA-4密切相关〔9,10〕，但卵巢腺癌与SSEA-4的相关研究尚缺少证据。本研究探讨不同分期的卵巢腺癌中SSEA-4表达及其与化疗耐药和预后的相关性。

1 资料与方法

1.1研究对象 以2012年1月至2016年1月衡水市人民医院收治的卵巢腺癌患者155例，所有患者经病理学确诊后行手术治疗且术前未经其他治疗，术后行化疗。入选患者按国际妇产科联盟(FIGO)标准分组：Ⅰ～Ⅱ期组(57例)、Ⅲ期组(75例)、Ⅳ期组(23例)。纳入标准：①具有完整的临床及随访资料；②无既往妇科手术史；③无既往放化疗、免疫治疗史且如愿亲未接受过抗肿瘤药物治疗；④术后采取正规化疗方案。排除标准：①合并患有慢性或代谢病者；②其他恶性肿瘤或者影响本研究的其他生殖系统疾病。本研究通过伦理审批，且所有患者签署知情同意书。

1.2免疫组化(SP)法检测组织中SSEA-4表达 所有患者行手术治疗，取病灶组织。运用SP法对组织内SSEA-4表达进行检测，通用型SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗人SSEA-4抗体购自美国Sigma-Aldrich公司。具体步骤：甲醛对标本进行固定后用石蜡包埋。切4 μm厚度薄片后使用梯度酒精及二甲苯进行脱蜡， 15 min H2O2处理组织切片，后进行微波抗原修复，再自然降温封闭后，抗人1∶50稀释的多克隆SSEA-4抗体滴加，4℃过夜。通用型二抗工作液滴入，37℃条件下30 min；后SP工作液滴加，37℃条件下15 min；后运用AEC进行显色，苏木素进行复染后封片。阅片采用双盲方法。

1.3判读标准 根据阳性着色程度积分综合计算：1分：弱阳性(+)；2分：中等阳性()；3分：强阳性()。根据阳性细胞数赋分如下：1分：<25%的细胞呈弱阳性(+)数；2分：25%～49%的细胞呈中等阳性()数；3分：≥50%的细胞呈强阳性()数。上述两者乘积<3为阴性，≥4为阳性，共观察5个高倍镜视野(HP)后取平均。

1.4化疗疗效评定 本研究采用铂类+紫杉醇行的EOC一线化疗方案系统治疗所有患者，间隔21 d每疗程，所有患者6～8个疗程，在停止化疗4 w以上对患者进行疗效评价。根据B超、CT或二次探查术结合盆腔检查、腹部检查、肿瘤标记物水平〔糖类抗原(CA)125、癌胚抗原(CEA)、CA199等〕进行疗效评价。化疗疗效标准〔3〕：完全缓解(CR)：肿瘤完全消失至少4 w；为部分缓解(PR)：肿瘤缩小>50%且疾病至少4 w无进展；稳定(SD)：至少4 w肿瘤缩小≤50%，肿瘤增大≤25%；疾病进展(PD)出现新病灶或肿瘤增大>25%。在第6或第8个疗程结束后对患者进行化疗反应评价：化疗无效：SD+PD；化疗有效：CR+PR。以下情况出现即为化疗耐药：①临床症状在初次化疗后未消失，有包块通过B超和盆腔检查，未有下降至正常临床证实缓解状态的血清CA125；②短期内有效在初次化疗后但复发出现在化疗结束后6个月以内的相对较短时间。

1.5随访 患者治疗后达到临床CR后定期进行门诊复查，生存期以电话形式进行随访。复发为半年后出现以下现象：胸腹水、肿瘤标记物、不明原因肠梗阻或影像学检查或查体发现肿块、随访率为100%。

1.6统计学分析 采用SPSS19.0软件进行方差分析或χ2检验。

2 结 果

2.1不同分期及SSEA-4表达的卵巢腺癌患者一般资料比较 不同分期卵巢腺癌患者淋巴转移及腹水差异有统计学意义(P<0.05)；不同腹水及淋巴结转移情况SSEA-4阳性表达差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同分期及SSEA-4表达患者一般资料比较〔n(%)〕

2.2SSEA-4在不同分期卵巢腺癌组织中表达情况 SSEA-4在Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ期卵巢腺癌中阳性表达〔34例(59.65%)、64例(85.33%)、22例(95.65%)〕差异显著(χ2=17.674，P=0.000)。见图1、图2。

图1 SSEA-4在卵巢腺癌中阳性表达(HE染色，×100)

图2 不同分期SSEA-4蛋白在卵巢腺癌中表达

2.3SSEA-4表达与近期化疗反应的关系 SSEA-4阴性表达组化疗有效及化疗敏感性显著高于SSEA-4阳性组(P<0.001)。见表2。

表2 SSEA-4表达与近期化疗反应的关系〔n(%)〕

2.4不同预后患者SSEA-4表达水平比较 SSEA-4阳性表达患者死亡及复发〔69例(95.83%)〕较SSEA-4阴性表达患者〔3例(4.17%)〕显著偏高(χ2=29.403，P=0.000)，即SSEA-4阳性表达越高，患者预后越差。

2.5不同SSEA-4表达患者生存率比较 SSEA-4阳性组3年生存率、5年生存率显著低于SSEA-4阴性组(P<0.05)，1年生存率差异无统学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同SSEA-4表达患者生存率比较〔n(%)〕

2.6SSEA-4表达与不同卵巢腺癌分期患者化疗情况及预后的相关性 SSEA-4阳性表达、不同卵巢腺癌分期与患者化疗有效、耐药性、复发均呈显著正相关(P<0.05，P<0.001)，见表4。

表4 SSEA-4表达与患者分期及预后的相关性

3 讨 论

卵巢恶性肿瘤发病率居于妇科恶性肿瘤中第3位，仅次于宫颈癌及子宫内膜癌，具有发病隐匿、易侵袭、易转移等特点，近年来发病越来越趋于年轻化〔11，12〕。5年生存率仅为20%～30%，居妇科肿瘤死亡率第1位〔13〕，究其死亡率高的原因可能为如下两方面：一是缺乏早期筛查、病情评估及预后判断的指标，大部分患者确诊即为中晚期〔14〕；二是肿瘤的化疗耐药性〔15〕。可见以上两点是领域内关于疾病发生发展的重点与热点。SSEA-4作为女性恶性肿瘤中具有明显异常表达的指标〔16〕，其在卵巢癌患者中亦存在异常表达〔16〕，但两者在不同分期卵巢腺癌中的表达研究及对预后及化疗耐药性的反应价值仍相对较不足〔17〕。

有研究表明，EOC发生的诱因可能是长期的不间断排卵〔18〕，本研究结果与国外相关研究结果相一致〔19〕，提示卵巢腺癌的发生可能和绝经及妊娠次数无关。SSEA-4在肿瘤环境的发展或维持中具有潜在作用〔20〕，SSEA-4也被证明在乳腺和卵巢肿瘤的化疗耐药和肿瘤干细胞群体中表达〔21〕，这与本研究结果类似。提示SSEA-4可能参与了卵巢腺癌的发生发展过程，与肿瘤转移及腹水密切相关，这与大部分以往研究结果相一致〔22,23〕。其机制可能与SSEA-4参与人原始生殖细胞(PGCs)的自我更新、增殖及多向分化有关，而PGC迁移到未来的性腺嵴，在那里它们随着性腺进行性别决定而定居。在性腺中，PGC分化为雄性生殖腺、雄性生殖腺或雌性生殖腺〔24〕。分析SSEA-4与卵巢癌发生发展的关系可能与其对PGCs的调节作用有关，具体作用机制还需进一步研究。

本研究中相关性分析结果提示，SSEA-4的表达状态可作为患者对化疗耐药性及预后的预测指标。且多项文献报道SSEA-4表达与多种癌症的化疗药物疗效具有显著相关性，可作为预后指标之一〔25,26〕。关于SSEA-4对耐药性的影响，有可能因为SSEA-4在控制细胞增殖及凋亡的基础上，增强了其耐药性等因素的影响，其具体作用机制仍需要进一步基础研究明确。

综上，SSEA-4在卵巢腺癌中的表达与肿瘤分期显著相关，其在不同分期卵巢腺癌中的差异性表达可能参与了卵巢腺癌的发展过程，可作为卵巢腺癌恶行程度的评价指标。SSEA-4与患者化疗耐药及预后显著相关，其表达强度可有效反映患者对化疗的敏感程度，可作为化疗耐药及预后的指标，可能成为卵巢腺癌肿瘤恶性程度、近期化疗疗效及远期预后的有效指标。