Skp2蛋白与原发性胃癌预后的关系

张永健 郭学海 高秀凤 王斌 赵宏阳 张敬

(开滦总医院林西医院 1普外科，河北 唐山 063103；2消化内科)

原发性胃癌是常见的胃肠道恶性肿瘤之一，发病率居我国第2位，死亡率居恶性肿瘤第3位，具有高发病率和高死亡率的特点〔1,2〕。胃癌的发病机制目前尚不明确，大多数患者在确诊时已属于胃癌中晚期，治疗效果和愈后不佳，因此，胃癌的发生发展和浸润转移机制的研究对于患者的治疗和愈后有重要意义。胃癌主要的治疗方式为手术治疗，辅以放化疗，早期胃癌患者通过早期手术可明显提高治疗效果，5年生存率可达50%以上，但是晚期胃癌往往治疗效果不佳，因此早发现和早治疗对于胃癌患者的预后和减少经济负担有重要意义〔3,4〕。目前胃癌临床领域中缺少公认的预后标志物，尤其对于中晚期胃癌患者，一线化疗方案的无进展生存时间仅6～9个月〔5〕。研究发现恶性肿瘤发病机制之一为细胞周期调节紊乱，细胞S期激酶相关蛋白(Skp)2是F-box蛋白家族成员之一，在细胞周期调节中发挥重要作用，在肿瘤的发生和发展中有重要意义〔6,7〕。研究发现Skp2不仅参与降解蛋白酶体，并且与致癌有关的转录基因c-myc的泛素化相关，是目前研究的重点和热点〔8〕。p27是近年来研究较为热门的抑制癌症发生发展的调控基因，p27通过阻止各种细胞经过G1-S期。p27表达水平低和癌症的预后不好和恶性肿瘤的程度是相互有关系。实验证明 Skp2蛋白在肿瘤中的表达及癌症临床病理学行为有密切相关。Skp2过表达与许多肿瘤的发生、发展和预后密切相关。这些与肿瘤的早期诊断及治疗有密切关系。本研究分析Skp2蛋白在胃癌中的表达情况，并探讨Spk2蛋白与原发性胃癌预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年6月至2018年11月于开滦总医院林西医院就诊的原发性胃癌患者67例为观察组，并纳入63例病理组织检查正常非癌性胃黏膜为对照组，观察组平均年龄(65.46±6.89)岁，男36例，女31例，对照组平均(66.15±7.41)岁，男29例，女34例。收集两组性别、年龄、病程、病理分期等一般资料。每3个月通过门诊或电话形式进行随访，末次随访时间2020年1月。本研究经医院伦理委员会批准，患者及其家属同意签署知情同意书。纳入标准：(1)患者确诊为原发性胃癌患者；(2)病理诊断和病理分期明确。(3)患者临床资料完整。排除标准：(1)患者曾接受过化疗、放疗等抗肿瘤治疗；(2)患合并其他系统严重病变者； (3)患者不同意签署知情同意书。

1.2观察指标

1.2.1试验操作 所有患者取病理组织，所有胃癌组织均在离体30 min内切取，置于0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理过的干燥试管中(试管内加入RNA保护液)，然后放入-80℃冰箱中保存。胃癌组织芯片常规脱蜡并且梯度酒精水化，用3% H2O2覆盖组织15 min，消化内源性过氧化物酶，抗原修复采用枸橼酸盐修复液在92℃煮15 min，冷却至室温；滴加一抗Ezrin，湿盒内4℃冰箱过夜，滴加免疫组化试剂PV-9000免疫复合物，温箱内孵育半小时，二氨基联苯胺(DAB)室温显色3～10 min，流水冲洗15 min；苏木素复染细胞核15 s；梯度酒精脱水，树胶片封片。每一步骤间均用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗。DAB显色试剂盒和PV-9000试剂盒及购于北京中杉金桥生物技术有限公司，所有操作按照说明书严格进行操作。

1.2.2结果判读〔9〕Skp2蛋白在胃癌组织上皮细胞的细胞核呈棕黄色颗粒，随机选择5个高倍视野(400倍)计数阳性细胞数，取其平均值作为该例的阳性率，并判定细胞染色强度。阳性细胞比例评定标准：>75%为4，51%～75%为3，26%～50%为2，5%～25%为1，<5%为0。染色强度评分标准：棕褐色为3，棕黄色为2，淡黄色为1，无着色为0。两项结果相加为标记指数(LI)，并通过LI判断表达强度和表达阳性率。<2为阴性(-)，2～3为弱阳性(+)，4～5为中度阳性()，6～7为强阳性()。阳性率=(弱阳性+中度阳性+强阳性)/总例数。

1.3统计学分析 采用SPSS22.0软件，非正态分布计量资料以中位数表示，正态分布采用t检验、χ2检验，绘制生存曲线，用Kaplan-Meier法计算，组间比较用Log-Rank 法检验。

2 结 果

2.1Skp2蛋白表达水平比较 观察组Skp2蛋白表达阳性率(55.22%，其中强阳性21例，中度阳性10例，弱阳性6例，阴性30例)高于对照组(15.87%，其中强阳性3例，中度阳性4例，弱阳性3例，阴性53例)，差异有统计学意义(χ2=6.781，P<0.05)，见图1。

图1 Skp2蛋白在胃癌组织中表达水平(DAB，×200)

2.2Skp2蛋白表达水平与临床资料相关性 Skp2蛋白表达阳性患者肿瘤分化程度、淋巴结转移情况较阴性患者差，TNM分期、肿瘤直径明显大于Skp2蛋白表达阴性患者(P<0.05)，而性别、年龄、病程、浸润深度无明显差异(P>0.05)，见表1。

2.3Skp2蛋白阳性表达的Logistic回归分析 以Skp2蛋白阳性表达为因变量，淋巴结转移(有=1，无=0)、TNM分期、分化程度为自变量建立多元回归模型，结果显示淋巴结转移(OR=1.174，P=0.004)、TNM分期(OR=1.340，P=0.005)、分化程度(OR=1.782，P=0.002)是Skp2蛋白阳性表达的危险因素，见表2。

表1 Skp2蛋白表达水平与原发性胃癌患者临床资料相关性(n)

表2 原发性胃癌患者Skp2蛋白阳性表达的Logistic回归分析

2.4Skp2蛋白表达与预后的关系 Skp2蛋白表达阳性中位生存时间为13个月(95%CI：10.4～16.2个月)，2年生存率为32.64%；Skp2蛋白表达阴性中位生存时间为27个月(95%CI：22.5～30.8个月)，2年生存率为68.63%。Kaplan-Meier 生存曲线分析发现Skp2蛋白表达阴性生存率明显高于Skp2蛋白表达阳性组(P=0.001)，见图2。

图2 Skp2蛋白表达与原发性胃癌患者预后的关系

3 讨 论

近年来，随着诊断和治疗水平的提高，胃癌的5年生存率明显提高，但是在我国胃癌的死亡率占恶性肿瘤的死亡率的1/5左右，是危害人民身体健康和生命安全的主要疾病之一。加强对胃癌发生发展的研究，寻找与胃癌相关的生物学指标，将有助于胃癌的诊疗〔10,11〕。原发性胃癌的发生和发展使一个多因素、多阶段、多基因共同作用的结果，细胞周期调节功能异常是细胞癌变中的一个重要过程，研究发现，多种细胞因子和癌性蛋白在调节细胞周期中起重要作用〔12,13〕。Skp2是由436个氨基酸残基构成的蛋白，其基因定位于人的第5号染色体，Skp2通路编码两种蛋白质，Skp2B蛋白和Skp2蛋白，在正常细胞中，Skp2蛋白与Skp2B 蛋白表达可以通过泛素依赖作用抑制p5和Rb通路，，能与S期激酶cyclinA-CDKI相互作用，在G0/G1期表达较低，在S期表达相对较高，可通过转化生长因子(TGF)-β信号转导通路与Smad4 蛋白因子相互作用。当基因发生突变时，Skp2通过乙酰化作用和泛素化依赖的蛋白水解途径与Smad4 蛋白因子的相互结合加强，通过乙酰化作用和泛素化依赖的蛋白水解途径进一步使导致细胞调节周期紊乱，组织发生癌变，与肿瘤的发生发展和预后相关，是目前研究的热点之一〔14,15〕。

本研究结果表明，Skp2在胃癌组织中的表达量明显高于正常组织。研究发现〔16〕，Skp2在多种组织中表达增加，且与不良预后具有一定的相关性，不仅可通过泛素化途径抑制Rb和p53通路，而且能降解抑癌基因p27，从而发挥调解细胞周期和调控肿瘤临床病理行为的作用。廖顺鸿〔17〕研究发现，Skp2蛋白在前列腺癌组织中高表达，而p27蛋白表达较低，且Skp2蛋白与p27蛋白存在负相关性，推测Skp2蛋白与p27蛋白在前列腺癌的发生和进展中发挥重要作用。刘小辉〔18〕采用组织免疫化学法发现Skp2蛋白在结直肠癌组织中高表达，且Skp2蛋白的靶标是p27，进一步证实了Skp2蛋白与p27蛋白在癌组织中的相关性。本研究结果表明，Skp2蛋白表达水平与肿瘤分化程度和TNM分期、淋巴结转移情况、肿瘤大小相关。研究发现〔19〕，癌症组织的肿瘤分型和大小、癌症组织、淋巴管转移与Skp2蛋白高表达相关，其机制目前研究尚不明确，猜测可能通过对凋亡的抵抗、潜在高侵袭性和活动性、高增殖活性等Skp2蛋白的生物学改变相关。孙雅静〔20〕发现在霍奇金淋巴瘤患者中Skp2阳性率高时疾病的恶性程度越高，Skp2阳性程度与病理分级呈正比。郭云霞等〔21〕发现干扰Skp2表达后，肝癌细胞的增殖能力受抑制，细胞侵袭力下调，凋亡能力增强，进一步证实Skp2与肝癌细胞增殖能力，癌症细胞的侵袭力相关。Shapira等〔15〕用免疫组化学染色法研究28例正常乳腺组织和69例乳腺癌组织中,观察并比较Skp2在其中的表达情况，随后用RT-PCR方法随机检测其中3例乳腺癌组织Skp2的mRNA 表达，并与其正常的胃黏膜作对比，结果显示,Skp2的mRNA 在胃癌组织中的表达明显上调，与正常胃黏膜比较Skp2蛋白阳性表达率在胃癌中明显升高,Skp2蛋白阳性表达率随着肿瘤的分化程度降低而升高，与本研究结果一致。

本研究结果表明，Skp2蛋白表达阳性组患者中位生存时间、5年生存率明显高于Skp2蛋白表达阴性组，Skp2蛋白对于原发性胃癌的预后有一定的价值，临床上可通过检测Skp2蛋白的表达水平判断胃癌患者的预后。吴金训〔22〕对浸润性宫颈癌患者的研究发现，Skp2蛋白可能是宫颈癌恶变的重要生物学标记物，与p27蛋白共同参与宫颈癌的发生发展，Skp2蛋白表达阳性患者的5年生存率明显低于Skp2蛋白表达阴性患者。

综上，Skp2蛋白胃癌组织中的表达水平增加，与肿瘤分化程度和分期、转移情况、肿瘤大小相关，且Skp2蛋白表达阴性患者的预后明显优于Skp2蛋白表达阳性患者，对判断患者的预后有一定的价值。