石见穿治疗小鼠肾结石的活性部位筛选及其化学成分分析*

刘漫 ，蒲莲莲 ，杨颖 ，刘陶世 ，嵇晶 ，程建明

1 南京中医药大学药学院 江苏南京 210023

2 江苏省经典名方工程研究中心 江苏南京 210023

肾结石是肾脏中沉积的矿物质结晶，临床上最常见的是草酸钙结石，约80%的肾结石是由草酸钙晶体发展而成[1]。肾结石会造成排尿困难，引起剧烈腰痛甚至血尿。其在全世界的患病率呈上升趋势，严重威胁患者的健康和生活质量。

目前，肾结石的主要治疗方式包括手术治疗和服用解痉、抗炎药物[2]。但患者术后结石残留率及复发率仍居高不下。有研究表明用药不当也会引发肾结石[3]会不同程度的对肾组织造成损伤。中医药疗法通过对因疗法和对症疗法相结合，通过改善机体体质的同时促进结石排出体外，不会对肾组织造成不良反应，与西医治疗相比具有一定优势和开发潜力。

石见穿又名华鼠尾草、小丹参、紫参。为唇形科植物鼠尾草（Salvia chinensis benth） 的干燥地上部分，味辛；苦；性微寒。具有清热利湿，消肿利水的作用。现有研究表明石见穿含有酚酸类[4]、三萜类[5]、黄酮类[6]等活性成分。近年来石见穿作为治疗结石中药被广泛应用于各组方中，但目前其抗结石作用笔者尚未见国内外相关文献报道。因此，本研究采用乙醛酸盐诱导肾结石法建立小鼠肾结石模型[7]，系统溶剂提取法制备石见穿不同活性部位。运用化学分析与药理相结合的方法筛选石见穿治疗肾结石的活性部位。扩大石见穿的药效范围，为后续新药开发奠定基础。

材料与方法

1 仪器设备

旋转蒸发仪（上海 EYELA OSB-2200），酶标分析仪（Infinite F50）；高速离心机（上海安亭 TGL-16G）；切片机（LEiCA RM2016上海徕卡仪器有限公司），包埋机（JB-L5，武汉俊杰电子有限公司），Kromasil-5C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Ultimate 3000高效液相色谱仪（1000 mm×1000mmm×1000 mm）、SIL-20A XR UFLC 仪（日本 岛津 公 司）、Triple TOF 5600System MS/MS高分辨三重四极杆飞行时间质谱仪（美国 AB Sciex公司）。

2 化学试剂

甲醇（TEDIA，批号 21080394）、甲酸（阿拉丁，批号 20160412）、乙腈（TEDIA，批号 21070272），95% 乙醇（无锡市亚盛化工有限公司 20220120），石油醚（广东光华，20130909）乙醛酸溶液（50%水溶液，阿拉丁K2002091），氢氧化钠（沪试，国药集团化学试剂有限公司，批号：10019762）生化分析试剂盒：肌酐（Cr）试剂盒，血清尿素氮（BUN） 测试盒。乙醇（国药集团化学试剂有限公司100092683）、二甲苯（10023418国药集团化学试剂有限公司）、HE染液（71014460上海经科化学科技有限公司）。

3 实验动物

ICR小鼠（18～22g）60只雄性，SPF级由杭州医学院提供，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002。动物合格证编号：20211026Abzz0100000231动物伦理申请单号：202108A009。小鼠饲养于20～25℃、相对湿度40%环境中，自然昼夜节律光照，适应性饲养一周。自由饮水、进食，实验前及实验过程中小鼠均以全价颗粒饲料喂养。

4 药材

石见穿药材饮片购自安徽亳州市康易饮片有限公司，批号：20210711，产地：江苏，经南京中医药大学药学院刘训红教授鉴定为为唇形科植物华鼠尾草Salvia chinensis Benth 的地上部分。

5 方法

5.1 石见穿各部位样品的制备 ①石油醚部位的制备：取石见穿饮片适量，用10倍量的石油醚（60～ 90℃）加热回流提取2次，1 h/次，过滤，合并滤液；滤液减压浓缩回收溶剂得到浸膏，即为石油醚部位，药渣备用。②醇部位的制备：将上述药渣挥去残留石油醚，用10倍量的95%乙醇加热回流提取2次，1 h/次，过滤，合并滤液。滤液减压浓缩回收溶剂得到浸膏即为95%乙醇部位，药渣备用。③水部位的制备：取②残留药渣，挥去残留乙醇，用10倍量的水加热回流提取2次，1 h/次，过滤，合并滤液。滤液减压浓缩回收溶剂得到浸膏即为水部位，制备工艺流程图见图1。

图1 石见穿各部位提取工艺流程图

5.2 成石液的配制 参考文献[7]，取50%的乙醛酸溶液1mL加注射用水稀释至100mL，用适量的NaOH调pH至7.4，得5mg/mL的乙醛酸盐溶液，即为成石液。

5.3 小鼠肾结石模型的建立及给药方案 健康小鼠60只，适应性饲养1周后，随机分成6组，每组10只，即空白组，模型对照组，阳性药物对照组，石见穿石油醚提取物部位组，石见穿95%乙醇提取物部位组，石见穿水提取物部位组。除空白对照组每天注射生理盐水外，其余各组均注射成石液，以给药剂量100mg/Kg、给药体积0.1mL/10g，连续腹腔注射2周。造模期间观察小鼠形态变化和监测体重。建模2周后随机取3只小鼠麻醉后处死解剖，取双肾浸泡于4%的多聚甲醛溶液，肾组织切片，观察。

实验期间各组小鼠自由摄食饮水，采取先造模后给药的方法。造模2周后，灌胃给予阳性药物组和石见穿各部位药物组小鼠相同剂量的相应药物（石见穿[8]：18.02 g/kg，临床 4 倍有效量；肾石通颗粒：4.51g/kg），空白组与模型组则灌胃蒸馏水，1次/d，给药体积均为10ml/kg，连续给药2周。

6 检测指标和方法

6.1 肾脏系数 肾脏系数=肾质量（g）/体质量（g）×100%，肾质量为小鼠肾脏的质量；体质量为小鼠的质量。

6.2 血清BUN（血清尿素氮）、Cr（血肌酐）水平 实验结束后，小鼠眼眶取血，静置1h后离心取血清，-20℃保存。使用全自动生化分析仪测定BUN（血清尿素氮）、Cr（血肌酐）水平。

6.3 肾组织病理学形态观察 取右侧肾脏4%用多聚甲醛固定，切片染色显微镜观察，病理切片组织学[9]观察实验小鼠肾皮质、髓质分界是否清晰，肾小球、肾小管等有无异常改变，肾间质内有无炎症细胞浸润及变性、出血等症状。通过钙结晶特异性染色Von Kossa[10]对小鼠肾脏石蜡切片进行染色，电子显微镜观察肾脏组织草酸钙结晶的分布与数量。

7 石见穿活性部位化学成分的鉴定分析

7.1 供试品溶液的制备 将上述“5.1”项下的浸膏用甲醇稀释成适宜浓度，10000 r/min 离心 10 min，取上清液，0.22um滤膜滤过，即得供试品溶液。

7.2 色 谱 条 件 Kromasil-5C18色 谱 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相 0.1% 甲酸（A）- 乙腈（B），梯度洗脱（0～ 6min，5% ～ 10%B；6～ 25min，10%～ 14%B；25～55min，14%～28%；55～70min，28% ～ 38%B；70 ～ 80min，38% ～ 95%B），体积流量1.0 mL/min；柱温 30℃；进样量 10 μL，PDA 检测波长为330nm。

7.3 质谱条件 电喷雾离子源正负离子模式；质量扫描范围m/z 50～1500；高纯度氮气，离子源温度600°C；气帘气流速40L/min；雾化气流速55L/min；辅助气流速55L/min；碰撞能量35V。

7.4 总离子流图的采集 取“7.1”项下经处理后的石见穿95%乙醇提取部位供试品溶液适量，按“7.2”项下色谱与“7.3”项下质谱条件进样分析，采集正、负离子模式下的石见穿有效部位总离子流图。

7.5 化学成分的鉴定分析 使用Peakview 2.0软件（美国AB SCIEX公司），对采集的质谱数据中的一级质谱碎片信息及精确准分子离子峰进行分析，计算其未知化合物的元素组成和可能的分子式（误差±5.0×106），对各色谱峰进行初步鉴定。再通过比对SciFinder数据库、二级质谱碎片信息，结合参考文献[11-12]进一步确认化学成分及结构。

8 统计学方法

通过 GraphPad Prism 8.3.0软件进行数据处理，数据以（±s）表示，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 肾脏系数

与空白组比较，模型组小鼠体质量减轻，肾质量、肾脏系数均增加，具有统计学差异（t=4.15，P=0.0010）提示造模成功。与模型组比较，阳性药物组、石见穿95%乙醇部位组、水部位组肾脏系数均显著性降低，表明石见穿对肾结石小鼠的体质量、肾质量、肾脏系数具有一定改善作用，对肾结石小鼠具有一定治疗作用。见表1。

表1 石见穿不同部位的ICR小鼠肾脏系数变化（±s，n=8）

表1 石见穿不同部位的ICR小鼠肾脏系数变化（±s，n=8）

注：与空白组比较#P<0.001，与模型组比较，*P<0.05，**P<0.001

组别 剂量/g·kg-1 肾脏重量/g 体重量/g 肾脏系数空白组 － 0.5268±0.0641 40.1445±4.8224 0.0131±0.0005模型组 － 0.4941±0.0312 33.9171±2.4196 0.0146±0.0009#肾石通颗粒组 0.451 0.4564±0.0362 41.0872±0.3504 0.0135±0.0004**石见穿石油醚部位组 1.802 0.4535±0.0236 34.4717±0.9313 0.0143±0.0010石见穿乙醇部位组 1.802 0.4580±0.0535 34.4732±5.1977 0.0134±0.0008*石见穿水部位组 1.802 0.4855±0.0515 35.9375±4.9198 0.0136±0.0006*

2 血清BUN（血清肌酐）、Cr（血肌酐）水平变化

与空白组相比较，模型组小鼠Cr（血肌酐）和BUN（血清肌酐）明显升高，具有显著性差异（P<0.001）；与模型组相比较，石见穿95%乙醇部位组和水部位组小鼠血清Cr（血肌酐）和BUN（血清肌酐）水平显著性降低。表明石见穿95%乙醇部位组和水部位组均有对草酸钙结石所致受损肾脏修复的作用；其中石见穿95%乙醇组的效果最好，能明显改善乙醛酸盐所致小鼠肾损伤。见表2。

表2 石见穿不同部位的ICR小鼠血清Cr、BUN（±s，n=8）

表2 石见穿不同部位的ICR小鼠血清Cr、BUN（±s，n=8）

注：与空白组比较#P<0.001 与模型组比较，*P<0.001

组别 剂量/g·kg-1 Cr/umol·L-1 BUN/pmol·L-1空白组 － 8.91±2.00 672.18±126.35模型组 － 26.86±1.27# 2024.21±127.39#肾石通组 0.451 13.13±1.52* 1126.60±103.25*石见穿石油醚部位组 1.802 23.90±2.14 1515.46±112.01石见穿乙醇部位组 1.802 17.62±1.52* 1102.35±145.24*石见穿水部位组 1.802 18.32±2.66* 1235.72±130.93*

3 肾组织病理学形态观察

以苏木精-伊红（HE）进行小鼠肾组织染色，如图2所示，显微镜下观察：空白组和肾石通颗粒组小鼠肾脏组织未见异常，肾小球内的毛细血管未见扩张，未见肾小管上皮细胞变性、坏死，未见炎细胞浸润。模型组小鼠肾组织整体结构异常，可见肾小球明显萎缩坏死，大量肾小管明显扩张，组织间质可见大量纤维结缔组织异常增生，明显纤维化，可见明显炎症细胞浸润。石油醚部位组小鼠肾组织整体结构异常，可见肾小管上皮细胞疏松水肿脱落坏死，组织可见炎症细胞浸润。乙醇部位组小鼠肾组织整体结构基本正常。肾小管、肾小球未有明显坏死等变性。水部位组小鼠肾组织整体结构轻度异常，肾小球组织可见少量肾小管上皮细胞脂肪变性。

图2 肾组织病理学形态（×200）

4 肾组织内病理性钙沉积情况

图3所示，显微镜下观察：空白组和阳性药物组小鼠肾脏组织未见草酸钙结晶。模型组小鼠肾组织整体结构异常，有大量草酸钙结晶存在。石油醚部位组小鼠肾组织整体结构异常，存在一定数量草酸钙结晶。乙醇部位组小鼠肾组织整体结构正常，无草酸钙结晶。水部位组小鼠肾组织整体结构基本正常，无草酸钙结晶。见图3（图中黑色箭头为草酸钙结晶）。

图3 肾组织内病理性钙沉积情况（×200）

5 95%乙醇部位化学成分鉴定

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术对石见穿95%乙醇部位进行全扫，其负离子模式下总离子流图如图4所示。根据数据处理方法，进行鉴定分析。在石见穿95%乙醇提取部位中，共鉴定出28个化合物，包括13个有机酸类，如：迷迭香酸、丹参酚酸等；5个三萜类化合物：山楂酸、积雪草酸等；4个黄酮类化合物，如芦丁、槲皮素；6个其他类成分。各化合物的保留时间（tR）等信息，见表3。

表3 石见穿95%乙醇部位化学成分解析

图4 石见穿95%乙醇提取部位总离子流

小结与讨论

目前认为，肾结石属上尿路结石，在中医学中属“石淋”“砂淋”“血尿”“腰痛”等范畴，其临床以腰痛尿道刺痛，排砂石为主症。草酸钙结石是泌尿系结石中最常见的类型，肾草酸钙结石患者的草酸钙结晶在肾小管上皮细胞中黏附形成结石颗粒，所造成的肾小管上皮损伤可进一步导致肾功能损伤，草酸钙结晶易在受损部位沉积加剧肾脏损伤，如此往复给患者带来较大困扰和痛苦，严重威胁患者的生命健康。因此，对草酸钙结石进行及时有效的治疗显得十分重要。本研究采用乙醛酸注射法诱导创立肾草酸钙结石小鼠模型并进行相关研究，研究中发现肾草酸钙结石小鼠血肌酐、血尿素氮水平升高，提示肾草酸钙结石可对肾功能造成较为明显的影响。草酸钙堆积在肾小管及肾小球中，形成结晶体，阻塞肾小管，并且通过炎症反应、氧化应激、细胞凋亡与坏死和纤维化等途径，造成肾脏损伤。

本研究从石见穿对肾草酸钙结石引起的肾脏损伤具有“溶石”和修复作用为切入点，对石见穿石油醚部位、95%乙醇部位、水部位进行药效筛选，得出石见穿95%乙醇部位能够显著降低肾草酸钙结石小鼠血清肌酐、尿素氮水平，并且能够溶解小鼠肾脏草酸钙结石。提示该部位有良好的肾损伤修复和溶石作用为扩大石见穿药效范围提供了依据。中药所含成分较多且较为复杂，因而其具体药效物质基础以及作用机制不甚明确。口服的中药可通过吸收入血的成分发挥药效，因此这些入血成分可能是中药发挥疗效的物质基础。基于此，后期将对石见穿入血成分进行分析，探讨石见穿的入血成分，为更进一步阐明其药效物质基础提供参考。