川芎-赤芍治疗下肢动脉硬化闭塞症的网络药理学机制

蔡金涛，李华刚

1 安徽中医药大学 安徽合肥 230038

2 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

下肢动脉硬化闭塞症（arteriosclerosis obliteran，ASO）以下肢凉、疼痛、麻木、间歇性跛行为临床表现的疾病，病变部位多发生于大、中动脉，尤其为腹部主干血管以下的分叉起始端。其发病率与年龄成正相关，70岁以上发病率在15%-20%，男性患者多于女性[1]。中医将该病称为“脉痹”、“脱疽”，本病病因多为寒邪侵袭、外伤、饮食不节，病位在血脉，涉及肝、脾、肾，血脉瘀阻或气血亏虚，导致下肢失养[2]。

我院国家级名老中医周玉朱在临床中运用自拟的“丹参化瘀汤”治疗ASO，其对ASO的治疗收到了较为满意的效果。其方可活血化瘀，通络止痛，但其具体机制尚不明确。

在丹参化瘀汤中，川芎辛温香燥为血中气药，走而不守，能入血分，下行可达血海，适宜瘀血阻滞各种病症。赤芍苦微寒，清热凉血，活血祛瘀，二者相互配合而发挥重要作用。因此，本研究选取药对川芎、赤芍，以网络药理学方法分析其治疗下肢动脉硬化闭塞症的作用机制，以期为丹参化瘀汤相关临床应用提供潜在机制。

方 法

1 川芎-赤芍药对有效成分筛选

TCMSP 数 据 库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）挖掘，检索标准设定为口服利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18，筛选川芎、赤芍的潜在有效成分，并检索文献补充。通过输入2味中药的名称，筛选得到有效药物成分所对应的靶点。通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）进行靶点蛋白-人类基因名称转换，从而得到川芎、赤芍两味中药的作用靶点。

2 下肢动脉硬化闭塞症相关靶点筛选

以“arterial occlusive”为关键词，在 GeneCards数据库、 OMIM 数据库、TTD 数据库、PharmGkb数据库以及 DrugBank 数据库中检索，获得疾病相关靶点。将各个数据库所得到的的靶点信息导入Cytoscape3.8.0软件，并用 R软件（https：//cran.r-project.org/mirrors.html）构建疾病相关基因合并的venn图。再将川芎、赤芍成分作用靶点和下肢动脉硬化闭塞症相关的疾病靶点利用R软件进行映射构建venn图，筛选出中药-疾病的共同靶点。

3 化学成分-靶点网络构建

将药物有效化学成分与疾病的共同靶点基因导入Cytoscape3.8.0软件，进行图像可视化处理。

4 川芎-赤芍药对治疗下肢动脉硬化闭塞症的核心靶点筛选

将药物关键化学成分与疾病的共同靶点，运用STRING 数据 库（https：//string-db.org/），在“Multiple Proteins”中将筛选出的共同靶点输入“list of names”，其中种类设为“Homo sapiens”，在设置中选择“highest confidence（0.9）”。构建 PPI网络模型，导出 png图片和tsv文件。将tsv文件导入Cytoscape软件中，通过Network Analyse功能分析其网络，筛选节点度值（Degree）分布、接近中心性（Closeness centrality）、介数中心性（Betweenness centrality）均在中位数以上的作为“核心靶点”。通过筛选最后得到MAPK14、AKT14、RELA、TP5等共17个PPI网络核心基因。

5 基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

利用R软件对上述得到的核心靶点进行entrezID的转换，再将转换的ID通过R软件进行GO富集分析和KEGG富集分析，以此获得川芎、赤芍治疗下肢动脉硬化闭塞症的GO富集分析及KEGG富集分析。将靶点基因、GO生物功能、KEGG信号通路导入Cytoscape3.8.0软件，绘制核心靶点-信号通路-生物功能图。

结 果

1 川芎-赤芍药对有效成分及靶点的筛选

TCMSP平台共收录赤芍的主要化学成分为119个，川芎主要化学成分为189个，符合筛选条件的赤芍有效成分29个，川芎有效成分为7个，其中谷甾醇是两者共有的成分，具体有效化合物的相关信息如表1所示。运用TCMSP中的Related Targets筛选到作用靶点赤芍682个、川芎1356个。筛选与有效成分相关的靶点并去除重复后共获得靶点201个。

表1 川芎-赤芍化合物相关信息

2 下肢动脉硬化闭塞症相关靶点的筛选

输入“arterial occlusive”，得到不同数据库的疾病靶点基因，删除每个数据库中及相互之间的重复基因，最终得到疾病基因，其中GeneCards 1916个，OMIM 1 个，PharmGkb 76 个，TTD 70 个，DrugBank 2个，并绘制venn图。见图1。将其与药物靶点基因进行对应，得到药物-疾病共同靶点基因共63个，并绘制venn图。见图2。五个数据库共获得靶点2065个，筛除重复靶点后最终获得靶点数量1984个。

图1 疾病靶点venn图

图2 川芎-赤芍治疗ASO venn图

3 川芎-赤芍药对治疗下肢动脉硬化闭塞症的关键化学成分-靶点网络构建

应用Cytoscape 3.8.0软件将药物-关键化学成分-疾病-靶点基因网络进行可视化处理。 图中矩阵代表靶点，倒三角代表化合物，其中不同颜色代表化合物来源于不同的药物。见图3。

图3 药物-关键化学成分-靶点网络

4 PPI分析及核心靶点筛选

将药物靶点与疾病靶点取交集后获得治疗靶点数量为63个，通过STRING数据库获得靶蛋白相互作用信息，并导出tsv文件及png图，如图4所示。图中共有节点46个，边120条。将tsv文件导入Cytoscape中对网络中所有节点的拓扑参数筛选节点度值（Degree）分布、接近中心性（Closeness centrality）、介数中心性（Betweenness centrality）进行分析筛选，共得到核心靶点17个，见表2。包括丝裂原激活蛋白激酶 14（MAPK14）、p53 基因（TP53）、丝氨酸 /苏氨酸激酶1（AKT1）、过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）等。

表2 核心靶点拓扑分析表

图4 川芎-赤芍治疗下肢动脉硬化闭塞症PPI图

5 GO 富集分析和 KEGG 通路富集分析

使用R软件对核心靶点分别进行GO富集分析与KEGG通路富集分析。结果显示，川芎、赤芍两味中药富集到的BP包括：活性氧代谢过程、活性氧代谢过程的调控、对类固醇激素的反应等生物学过程，富集到的CC包括：RNA聚合酶II转录调节复合物、转录调节复合物等细胞成分，富集到的MF包括：脱氧核糖核酸-结合转录因子结合、核心启动子序列-特异性DNA结合、脱氧核糖核酸-结合转录激活活性等分子功能。与ASO相关的KEGG通路主要包括流体剪切应力与动脉粥样硬化、脂质与动脉粥样硬化、IL-17信号通路等信号通路发挥治疗下肢动脉硬化闭塞症的作用。见图5和图6。并通过Cytoscape软件构建成分-核心靶点-通路网络图。见图7。

图5 川芎-赤芍治疗ASO的GO富集分析

图6 川芎-赤芍治疗ASO的KEGG富集分析

图7 成分靶点通路网络图

讨 论

下肢动脉硬化闭塞症是由于下肢动脉粥样硬化斑块形成，引起下肢动脉狭窄、闭塞，进而导致肢体慢性缺血。其发病机制尚不明确，主要的包括损伤及平滑肌细胞增殖学说、脂质浸润学说、血流动力学学说、遗传学说、炎症反应等有关。中医认为血瘀为该病的主要矛盾[3]，活血化瘀应贯穿于整个治疗过程之中，大部分医家皆认可。

丹参化瘀汤是我院治疗ASO的有效经验方剂[4]，其中川芎、赤芍的配伍是此方必不可少的药对之一，川芎活血行气、祛风止痛，为血中之气药。赤芍活血化瘀止痛，两药相配伍，既可活血化瘀，又可行气止痛。本次研究即是通过网络药理学对川芎-赤芍药对治疗ASO的作用机制进行分析。

川芎中的有效成分可有效拮抗血小板聚集，改善血液黏稠度，还能扩张血管，能够有效增加下肢血流量、脑动脉流量[5]。赤芍的有效成分可抑制人类成纤维样滑膜的增殖，从而抑制炎症，以及保护神经、抗肿瘤、抗氧化等作用[6]。

本次通过运用网络药理学的研究方法，发现川芎赤芍药对中的β谷甾醇、鞣花酸、（+）儿茶素、芍药苷、黄芩素、杨梅酮等可能抗ASO的主要成分。

谷甾醇是川芎和赤芍的共有化合物，具有降脂、抗炎、清除自由基活性、参与免疫调节等。Yuan，Chuanxun[7]等研究发现提示β-谷甾醇和β-谷甾醇亚油酸酯（SELA）不同的载药方式可以促进小鼠总脂质和胆固醇的排泄。这可能是由于β-谷甾醇与胆固醇的分子结构相似，在小肠腔内取代了胆汁酸微胶束中的胆固醇，降低了胆固醇的吸收利用。Kasirzadeh[8]等观察到用1mg/kg剂量的β-谷甾醇治疗两天导致CLP诱导的脓毒症大鼠血清中的促炎细胞因子显着减少。在用β-谷甾醇治疗的大鼠中，TNF-α和NF-κBi的肝脏表达也降低了。β-谷甾醇靶向NF-κB作为细胞因子级联的主要调节因子，并在很大程度上抑制炎症反应。Jiang，Yue-Hua[9]等研究发现β-谷甾醇表现出优异的直接内皮保护作用，可显着抑制细胞凋亡，增加细胞迁移，改善HAECs的线粒体功能。此外，β-谷甾醇减轻了细胞骨架，降低了VE-钙粘蛋白的密度并改善了细胞形态。鞣花酸通过抑制ROS生成和调节PI3K/Akt/eNOS 信号通路在oxLDL刺激的内皮细胞中引起抗凋亡作用[10]。在葡聚糖-儿茶素处理的HMEC-1细胞中，ATOX-1水平显著下调[11]。证明了葡聚糖-儿茶素的强效抗血管生成特性。由此可以推断β-谷甾醇、鞣花酸、儿茶素可以通过抑制炎症反应、降低了胆固醇的吸收利用、抗凋亡作用、强效抗血管生成来治疗ASO。

本研究提示药物的有效成分主要作用于MAPK14、AKT1、PPARG、TNF、RELA、TP53等靶点，参与的通路主要包括流体剪切应力与动脉粥样硬化、TNF信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路等。

流体剪切应力表示血液流动在血管壁的内皮表面施加的摩擦力。血管暴露于剪切应力，尤其是内皮细胞似乎是主要的传感器，因为它们位于血液和血管壁之间的内表面。此外内皮细胞暴露于剪切应力会刺激内皮一氧化氮合酶（eNOS）产生一氧化氮（NO），能引起细胞内钙的急剧而短暂的升高，增强钙调蛋白与eNOS的结合，从而增加eNOS活性[12]。肿瘤坏死因子信号通路是宿主防御的一个非常重要的组成部分，在各种类型的损伤和刺激后会迅速释放。TNF-α在激活内皮细胞和上调粘附分子中具有重要作用[13]。TNF-α参与对病变中不同细胞类型的多种作用，例如粘附分子表达和泡沫细胞形成。通过TNF结合蛋白阻断TNF-α或通过IL-1受体拮抗剂阻断IL-1可部分保护apoE敲除小鼠免受动脉粥样硬化的影响。在MAPK信号通路中，miR-26a过表达能抑制p38MAPK的激活并下调VEGF表达，而miR-26a的沉默具有相反的效果[14]。VEGF是最有效的血管生成因子之一，它增加血管通透性和血管内皮细胞存活，p38MAPK的激活在调节VEGF水平中发挥作用。IL-17通过增强VEGF的表达，促进肿瘤内血管新生和炎症的发生[15]，从而参与调控血管新生的过程。

综上，本研究通过网络药理学的方法对丹参化瘀汤汤中的“川芎-赤芍”药对进行分析，发现抗炎是该药对治疗ASO的主要方式，此次研究佐证了前期对川芎-赤芍药对治疗 ASO的研究结论，通过筛选得到的靶点和相关信号通路为后续的研究提供了研究方向。因本研究缺少相关的实验验证，具有一定的局限性，是否与上述靶点和信号通路有关，需要进一步验证。