凉血解毒化瘀汤治疗肝衰竭的作用机制*

陆星宇，李盼，杨晶，张茜茜，彭建平

1 湖南中医药大学 湖南长沙 410208

2 湖南中医药大学第一附属医院 湖南长沙 410000

肝衰竭是因多种因素造成的肝细胞严重损害，导致肝脏出现严重功能障碍，并在临床表现出现以黄疸、腹水、肝性脑病、肝肾综合征、感染等症状[1]。肝衰竭在中医学中属于肝瘟范畴，古代医家对肝衰竭的一系列临床症候群的病因病机有一定的见解。古代医学认为肝衰竭是因为外感疫疠邪毒，同时内有湿热、瘀血、痰浊。我院谌宁生教授提出肝衰竭主要的发生发展的原因主要在于“毒”与“瘀”，并且提出肝衰竭不仅病情进展快，且病情易发生改变，在疾病发生发展过程中，易耗伤营血，所以在治疗肝衰竭时，创立了凉血解毒化瘀汤着重于解毒化瘀[2]。经过多年临床实践，我院孙克伟教授在黄疸的辨证基础上，提出了肝衰竭以“阳黄-阴阳黄-阴黄”的辨证方法[3]。在临床中，凉血解毒化瘀汤在治疗肝衰竭疾病时也得到了广泛的应用，但其具体作用机制尚未明确。本文根据中药复方及其靶点的特性，通过网络药理学及分队对接验证的方法，对凉血解毒化瘀汤治疗肝衰竭的作用机制进行分析，旨在为进一步研究提供新的研究思路和方向。

材料与方法

1 凉血解毒化瘀汤的活性成分及其作用靶点筛选

利用中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP），检索凉血解毒化瘀汤中的药物赤芍、丹参、虎杖、茵陈、栀子、大黄、白术的活性成分，因药物进入人体的吸收途径，通过药物动力学选取以口服生物利用度（OB） ≥ 30%、类药性（DL） ≥ 0.18 为筛选标准，进行凉血解毒化瘀汤的活性成分及其作用靶点进行筛选；再通过Uniport数据库对已认证的人类基因对蛋白质的作用靶点规范化。

2 肝衰竭疾病基因靶点筛选

通 过 Genecards数 据 库 以“liver failure”“liver injury”对疾病基因靶点进行筛选。并通过Genecards数据库中Score值选取Score值>中位数以上的靶点作为肝衰竭的潜在靶点；再通过关键词在TTD数据库中筛选，将检索结果与Genecards数据库筛选后的潜在靶点结果合并，删除重复基因靶点得到肝衰竭的相关靶点。

3 “ 活性成分-疾病基因”共同基因筛选及其网络构建

利用 CytoScape3.8.2构建“活性成分-疾病靶点”网络图，使用Cyto-Scape中的Network Analyzer功能进行网络拓扑分析，根据degree值及相互作用关系设置节点的大小。

4 PPI网络构建

将所获取的交集靶点信息导入String数据库，并将物种设定为Homo sapiens，其余参数设为默认值，得到PPI网络，将PPI网络导入CytoScape3.8.2，利用内置 cytoNCA 插件对 BC、CC、DC、EC、LAC 进行两次打分，根据得分大于中位值的基因，筛选出PPI的核心基因。

5 GO功能注释及KEGG通路富集分析

运用R语言及Bioconductor平台对基因进行编码，并通过利用Bioco-nductor 平台的DOSE，clusterProf-iler，pathview 数据包借助R语言绘制GO功能注释及KEGG通路富集分析图。

6 分子对接验证

根据筛选出的核心靶点及活性成分，利用PDB数据库获得相应的蛋白结构，使用Autodock_vina 软件对核心靶点与活性成分进行分子对接验证。

结 果

1 凉血解毒化瘀汤的活性成分及其作用靶点筛选

利用中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP）以OB≥30%，DL≥0.18为标准及ADME筛选，共得到符合条件的活性成分121个，其中白术4个、赤芍14个、大黄10个、丹参59个、虎杖10个、茵陈13个、栀子12个，根据其活性成分来源对其重命名，比如泽兰黄醇素来源于大黄，重命名为DH1；大黄素甲醚葡糖甙同样来源于大黄，重命名为DH2，以此类推。针对其多种药物共有的核心成分，其中β-谷甾醇为赤芍、大黄、虎杖、茵陈、栀子共同成分，命名为A；黄芩素为赤芍、丹参共有，命名为A1；儿茶素为赤芍、虎杖共有，命名为A2；豆甾醇为赤芍、栀子共有，命名为A3；油酸乙酯为赤芍、栀子共有，命名为A4；葡萄糖苷为大黄、虎杖共有，命名为B；大黄酚为大黄、虎杖共有，命名为B1；芦荟大黄素-8-葡萄糖苷为大黄、虎杖共有，命名为B2；木犀草素为丹参、虎杖共有，命名为C1；异欧前胡内酯为丹参、栀子共有，命名为C2；槲皮素为虎杖、茵陈、栀子共有，命名为D。对已获取的成分八点整合筛选后，共得到2277个作用靶点，删除重复靶点后可获得中药靶点共247个见表1。

表1 凉血解毒化瘀汤靶点

2 肝衰竭疾病基因靶点筛选

通 过 Genecards数 据 库 以“liver failure”“liver injury”筛选获得靶点11962个，其最高Relevance score为 73.20，最 低 Relevance sco-re为 0.11，选 取Score值>中位数2.83以上的靶点；再通过关键词在TTD数据库中筛选，将检索结果与Genecards数据库筛选后的潜在靶点结果合并，删除重复基因靶点得到6025个肝衰竭基因靶点。

3 “ 活性成分-疾病基因”共同基因筛选及其网络构建

将获得中药活性成分及肝衰竭疾病基因靶点取交集，得到共同靶点201个。利用 CytoScape3.8.2构建“活性成分-疾病靶点”网络图见图1，使用其内置插件Network Analyzer进行拓扑分析，Degree排名前5的活性成分见表2。

表2 凉血解毒化瘀汤有效组分对应的前10位靶点

图1 活性成分-疾病靶点

4 PPI网络构建

利用CytoScape3.8.2内置插件c-ytoNCA第一次 打 分 得 BC（b-etweenness）≥ 58.73218043，CC（closeness） ≥ 0.515625，DC（degree） ≥ 32，EC（eigenvector） ≥ 0.045051977，LAC（local average connectivity-based method） ≥ 20.45714286；第 二次 打 分 得 BC≥ 15.29512971，CC≥ 0.781609195，DC≥ 49，EC≥ 0.119799711，LAC≥ 40.28；根据两次得分>中位值筛选，共获得网络核心基因共30个见图2。

图2 PPI核心网络

5 GO功能注释

运用R软件及Bioconductor平台将凉血解毒化瘀汤-肝衰竭交互靶基因进行GO数据库富集分析，按照P<0.05为标准进行筛选，根据P值从小到大分别选取分子功能MF、生物学过程BP、细胞成分CC前10条通路绘制GO通路图见图3。由图可知凉血解毒化瘀汤和肝衰竭的共同靶点主要集中分布于膜筏、蛋白激酶复合物、质膜筏、突触后膜、突触膜、细胞器外模、线粒体外模等细胞组分中，通过RNA聚合酶II-特异因子结合、脱氧核糖核酸-结合转录、核受体活性配体-激活、转录因子活性蛋白酶结合、转录因子结合、细胞因子受体结合、细胞因子活性、类固醇激素受体等方式参与对异生素、脂多糖、细菌源性分子及氧水平的反应等生物进程，从而发挥凉血解毒化瘀汤治疗肝衰竭的作用。

图3 GO分子功能注释

6 KEGG富集分析

运用R软件及Bioconductor平台将凉血解毒化瘀汤-肝衰竭交互靶基因进行 KEGG数据库富集分析，设置P< 0.05为标准进行筛选，根据P值，从小到大选取前20条通路绘制KEGG信号通路图见图4。

图4 KEGG富集分析

由图可知凉血解毒化瘀汤核心靶点主要富集于AGE-RAGE、IL-17、HIF-1、TNF、PI3K-Akt、FoxO、C-型凝集素受体等多条通路，表明凉血解毒化瘀汤主要通过调控以上多条通路发挥治疗肝衰竭的作用。

7 分子对接验证

为了验证凉血解毒化瘀汤与相关靶标的关系及其作用机制，本研究选择了相关度高的10个靶点分别和凉血解毒化瘀汤中的3个有效组分STAT3、CASP3、IL6分别进行进行分子对接，分子对接结合自由可显示分子间的结合能力以及相互作用能力见表3。本位选取槲皮素和丹参酮分别与STAT3、CASP3、IL6做分子对接结果可视化见图5。

表3 分子对接自由功能

图5 分子对接可视化

讨 论

本研究通过运用网络药理学及分子对接验证探讨凉血解毒化瘀汤治疗肝衰竭的作用机制。通过研究结果可知槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇、山柰酚、丹参酮等是治疗肝衰竭的核心成分。TP53、IL6、TNF、STAT3等靶点是肝衰竭疾病治疗的重要靶点。基于GO和KEGG富集分析可知，其中AGERAGE信号转导途径、IL-17信号通路、HIF-1、TNF信号通路及脂质代谢与肝衰竭的发生发展有着密切关系。

现代医家谌宁生教授提出肝衰竭病机关键在于“毒”“瘀”，在治疗时提出重在解毒，贵在化瘀的观点。由表2可知，赤芍主要核心成分为β-谷甾醇、豆甾醇、黄芩素等，方中赤芍入肝经，清热凉血，活血化瘀，临床上在治疗肝衰竭时也多重用赤芍，阻断了肝细胞进一步受损[4]。茵陈的主要核心成分是槲皮素、β-谷甾醇等，方中茵陈清热利湿，为退黄之要药。虎杖的主要核心成分是槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素等，方中虎杖清热利湿。虎杖与茵陈配用有明显的抗菌、抗病毒及保肝利胆作用[5]。丹参的主要核心成分为木犀草素、丹参酮、鼠尾草酚酮等，方中丹参清热利血，使血脉通畅，瘀散结消。丹参可改善微循环增强肝脏血流量促进肝细胞修复与再生[5]。栀子的主要核心成分是槲皮素、β-谷甾醇，方中栀子清热利湿，凉血解毒。方中同时运用大黄泻火通便，利肝胆湿热，清除肠道内毒素；白术益气健脾。全方以凉血化瘀、清热解毒为宗旨，注重从肝衰竭“毒”“瘀”角度入手，从根本上治疗肝衰竭。

槲皮素可以通过抑制AGE-RAGE信号途径进而抑制 NF-κB、STAT1、cAMP、MAPK 等多条信号通路调控抑制iNOS的转录表达及NO释放，达到抑制炎症反应的作用从而抑制细胞凋亡及组织损伤[6]；其次槲皮素还可通过抑制HMGB1减少线粒体途径中细胞内活性氧（ROS）的产生和凋亡反应，从而达到保护L02细胞免受d-半乳糖胺诱导的细胞损伤[7]；槲皮素及β-谷甾醇具还可通过减轻CCL4诱导的氧化应激，激活Nrf2/Keap1信号通路产生细胞保护酶NQO1缓解CCL4诱导的肝损伤[8]。β-谷甾醇不仅具有抗氧化，抗炎的作用，同时可以参与免疫调节，可通过诱导HepG2/ SMMC-7721细胞凋亡，抑制D-半乳糖胺及脂多糖诱导的肝损伤[9]。木犀草素可通过抑制TXNIP-NLRP3炎症小体、TNF-α、IL-10和IL-6的产生改善脂多糖诱导的肝损伤[10]；还可通过下调对乙酰氨基酚诱导的硝基酪氨酸形成和内质网应激减少肝损伤中存在抗氧化、抗炎和抗雌激素受体应激特性[11]。豆甾醇可通过打开线粒体通透性转换孔、激活线粒体ATP酶（mATPase）活性和释放细胞色素c诱导线粒体依赖性凋亡[12]。山奈酚调节内质网应激-Grp78-CHOP信号通路，抑制p-JNK和Endo G蛋白来抑制乙酰氨基酚诱导肝细胞凋亡以达到肝细胞的保护作用[13-14]；还可以通过抑制 NF-κB 途径，减少炎症因子的产生从而达到减轻肝细胞凋亡[15]。

在核心PPI中，我们可知 TP53、IL6、TNF、STAT3等靶点发挥作用。STAT3经过IL-6的刺激磷酸化进入细胞核，参与基因转录，促进Th17细胞的增殖与分化，而Th-17细胞表达为IL-17因子造成肝衰竭[16]。TNF可以诱导细胞因子IL-6、IL-8等炎症因子的产生，进而诱导肝细胞的炎性反应，从而促使肝衰竭的发生[17]，TNF可以通过诱导炎症反应，同时与FAS死亡受体结合，可以激活凋亡起始物caspase-8，从而诱导细胞死亡；还可产生内毒素血症，诱导产生iNOS迅速升高等多种途径诱导肝脏炎症及损伤[18-20]。

AGE-RAGE信号转导途径的相互作用可造成一系列的炎症反应从而引起细胞凋亡及组织损伤，是肝衰竭形成的重要机制之一。RAGE是目前研究最多的AGE受体之一，其在许多细胞表面均有表达[21]。AGE通过与RAGE的结合从而激活NF-κB[22]。NF-κB具有显著的促进炎症的特性，同时也是细胞内炎症反应的重要通路之一，其可诱导大量炎症因子如TNF-α、iNOS、IL-1的产生从而加重肝细胞凋亡，而炎症因子的增加可进一步促进NF-κB的产生，从而形成恶性循环[23-24]；乙二醛酶的活性降低可以导致偶联蛋白-2减少从而引起线粒体功能障碍相关的氧化应激反应，增强肝脏蛋白质糖基化，加重了炎症诱导的肝损伤，通过rRAGE阻断AGE/RAGE结合能够完全消除与炎症损伤增加相关的线粒体功能障碍[25]，AGE和RAGE的可通过多元醇途径、蛋白激酶 C等途径结合引起细胞内活性氧（ROS）的产生，从而激活丝裂原活化蛋白激酶和NF-κB信号，产生炎症因子，引起细胞凋亡。本研究结果表明，凉血解毒化瘀汤可能通过参与调节AGE-RAGE的信号通路治疗肝衰竭[26]。

小 结

经过本研究的分析可知，凉血解毒化瘀汤可通过多成分、多靶点、多通路治疗肝衰竭，根据现有的研究数据表明槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇、山柰酚、丹参酮等可能是凉血解毒化瘀汤治疗肝衰竭的主要成分，猜测其主要可能通过多通路调节AGE-RAGE信号转导途径所引起的炎症反应、氧化应激反应，以及改善线粒体质量来抑制肝细胞凋亡。同时，通过运用分子对接探讨凉血解毒化瘀汤核心成分与肝衰竭疾病的核心靶点的结合能力，可以为凉血解毒化瘀汤治疗肝衰竭提供了一定的理论依据。

但在相关研究的过程中，发现基因TP53在肝衰竭疾病发生发展中的作用机制尚未明确，在接下来的临床及科研研究中，可以继续探讨并验证基因TP53在肝衰竭发生发展中的作用机制，是否可以通过调控基因TP53从而调控其相关的生物进程达到治疗肝衰竭的目的。

通过以上所述，结合网络药理学的研究可知，凉血解毒化瘀汤是通过多成分、多靶点、多通路达到治疗肝衰竭的效果。本次研究仅为凉血解毒化瘀汤治疗肝衰竭的机制进一步研究提供了新思路和新方法，为凉血解毒化瘀汤的临床应用提供了科学依据。但本研究未加入药理学实验验证，结果具有一定的局限性。