白贝肉酶解工艺的优化及其产物呈味特性研究

邓宇，曹文红,2*，陈忠琴,2，秦小明,2，高加龙,2，郑惠娜,2，林海生,2

(1.广东海洋大学 食品科技学院，国家贝类加工技术研发分中心(湛江)，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东省海洋食品工程技术研究中心，广东省海洋生物制品工程实验室，水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东 湛江 524088；2.大连工业大学海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116034)

水产品的风味主要由气味和滋味组成，挥发性的含香化合物构成其气味，非挥发性的呈味活性物质构成其滋味，滋味成分对水产品的风味有重要影响[1]。呈味物质主要包括呈味核苷酸、游离氨基酸、无机离子等，可以利用高效液相色谱仪、氨基酸分析仪、火焰原子吸收分光光度计等仪器进行检测[2]。目前国内外学者都对水产品的风味物质进行了广泛的研究。Kani等[3]研究了椭圆形鱿鱼外套膜肌肉中的呈味成分，得出11种呈味活性物质对该鱿鱼的滋味具有重大贡献；崔妍春等[4]比较了3种不同贝类蒸煮液的呈味物质，指出呈味核苷酸和甜菜碱对鲜味起到重要作用；钱建瑛等[5]比较了酶热处理后文蛤的呈味物质，指出游离氨基酸和呈味核苷酸对其鲜味有巨大贡献。水产品的风味在一定程度上反映了其新鲜程度，表明其潜在价值，对水产调味品的开发和利用具有指导意义。

白贝(Monetariamoneta)，别名贝子、贝齿、白海肥等，广泛分布于我国南海海域，营养丰富，味道鲜美，价格低廉。在广东、广西等地区常被用来煲汤，深受消费者的喜爱[6-7]。张大为等[8]以白贝自然发酵液为分离源，从中分离得到乳酸菌并对其进行鉴定。目前国内外针对白贝的研究相对较少，主要集中于调味液的初步研制、白贝抗氧化活性和理化性质，尚没有关于呈味特性的研究[9-11]。课题组前期研究显示，白贝蛋白质含量为10.26 g/100 g，占干质量的58.13%；脂肪含量为1.96 g/100 g，占干质量的11.1%；非蛋白氮含量为0.139 g/100 g，占总氮的8.47%，它是一种高蛋白、低脂肪、呈味物质丰富的海洋贝类，因此可能是开发天然海鲜调味料的理想原料。白贝目前以直接食用为主，但在运输和销售过程中极易发生腐败变质现象，不仅浪费原料，而且会出现食品安全问题。因此，如果以白贝为原料，通过酶解等方法加工成调味品等附加值高的产品，将会产生极高的经济和社会效益。

本文以白贝肉为原料，通过酶解法制备白贝酶解液，并对其进行呈味分析，为白贝天然海鲜调味品的研究与开发提供了实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜白贝：购自湛江市东风市场，去壳后洗净，将其水分沥干后用小袋分装(50 g)，放置于-20 ℃冰箱中备用。

动物蛋白酶(酶活100 U/mg)、菠萝蛋白酶(酶活300 U/mg)、中性蛋白酶(酶活100 U/mg)、木瓜蛋白酶(酶活800 U/mg)、复合蛋白酶(酶活150 U/mg)：广西庞博生物工程有限公司；甲醇(色谱级)；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

T18型高速分散机 德国艾卡仪器设备有限公司；Agilent 1200型半制备高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；SA402B型电子舌 日本Insent公司。

1.3 实验方法

1.3.1 白贝肉酶解产物的制备

称取40 g原料，按料液比1∶3 (mg/mL)加去离子水打浆，以8 000 r/min均质2 min，调节pH后加入蛋白酶，确定酶解温度和时间；酶解完全后，沸水浴15 min，待其冷却至室温后，用高速离心机10 000 r/min离心15 min(4 ℃)，用纱布过滤后取上清液，于4 ℃备用。

1.3.2 白贝肉水解蛋白酶的选择

选择动物蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和复合蛋白酶5种蛋白酶分别对白贝肉进行酶解；按“1.3.1”调节各蛋白酶最适酶解温度和pH，控制加酶量为3 000 U/g，酶解时间为3 h，料液比为1∶3，采用水解度(degree of hydrolysis，DH)作为测定指标，按水解度的高低筛选出最佳的水解蛋白酶。

1.3.3 白贝肉复合蛋白酶单因素实验

根据“1.3.2”选择水解度最高的复合蛋白酶进行单因素实验，探究其加酶量、料液比及酶解温度3个因素对白贝水解度的影响；设置料液比分别为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，酶解温度分别为40，45，50，55，60 ℃，加酶量分别为2 000，3 000，4 000，5 000，6 000 U/g，控制酶解pH 7.0和酶解时间3 h，以水解度作为指标，筛选出最佳条件。

1.3.4 响应面优化白贝肉酶解工艺

在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken原理，设计温度、料液比、加酶量三因素三水平实验，见表1。以白贝蛋白水解度为指标。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.5 酶解时间对白贝肉酶解工艺的影响

在响应面法优化的基础上，设置酶解时间分别为1，2，3，4，5，6，7 h，酶解pH为7.0，以水解度为指标，确定最佳酶解时间。

1.3.6 主要呈味物质测定

1.3.6.1 游离氨基酸测定

准确量取1 mL样品，加入5 mL质量分数为10%的三氯乙酸溶液，混匀后定容至25 mL，静置30 min后取上清液。将上清液在4 ℃下以10 000 r/min离心20 min，用水相滤膜过滤后采用氨基酸自动分析仪对其进行分析测定。

1.3.6.2 呈味核苷酸测定

参考司蕊等的方法进行测定，取0.30 g样品溶解完全后定容至10 mL，然后吸取5 mL溶液，向其中加入30 mL的冷高氯酸，振荡5 min后静置30 s，用高速离心机以8 000 r/min离心15 min后取上清液；先用KOH调pH值至6.50，放置于4 ℃冰箱中静置30 min将钾盐沉淀完全，用超纯水将过滤后的上清液定容至50 mL，用于HPLC分析。

HPLC条件：色谱柱为5C18-MS-Ⅱ(4.60 mm×250 mm,5 μm)；柱温为25 ℃；检测波长为254 nm；流动相A：0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液，流动相B：0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液与甲醇的混合液，进样量为20 μL；流速为0.70 mL/min。

1.3.6.3 有机酸测定

参考饶梦微等[12]的方法略作改动，取30 mL pH为2.5的NH4H2PO4溶液加入烧杯中，称取3.00 g样品加入其中并超声振荡30 min使其完全溶解，用高速离心机以8 000 r/min离心15 min后取上清液；沉淀，按上述步骤进行重复，将两次获得的上清液进行合并，用超纯水定容至50 mL容量瓶中用于HPLC分析。

HPLC条件：色谱柱为5C18-MS-Ⅱ(4.60 mm×250 mm,5 μm)；柱温为25 ℃；流动相：2%的NH4H2PO4溶液；流速为0.70 mL/min；进样量为20 μL；检测波长为205 nm。

1.3.6.4 甜菜碱测定

取25 mL超纯水，加入10.00 g样品，溶解完全后加入150 mL的乙醇溶液，溶液合并后放置于4 ℃冰箱中冷藏一夜后，用高速离心机以8 000 r/min离心15 min后取上清液；沉淀，按上述步骤进行重复，将两次获得的上清液进行合并，浓缩定容后得到样品制备液，制备液中甜菜碱含量的测定参照黄丽贞[13]的方法。

1.3.6.5 无机离子测定

Na+、K+含量：参考GB 5009.91-2017中火焰原子吸收光谱法测定；Cl-含量：参考GB 5009.44-2016测定；PO43-：参考GB 5009.87-2016测定。

1.3.6.6 滋味活性值(taste activity value,TAV)定义

呈味物质的浓度与其呈味阈值的比值用TAV表示，当TAV>1时，说明该化合物对滋味有贡献[14]。

1.3.6.7 电子舌测定

将Insent电子舌系统进行活化，加入水相过滤后的酶解液进行测定。以参比溶液作为对照，取3次测定结果，对酶解产物进行滋味分析。

1.4 数据处理

每组实验需要进行3组平行，实验数据以“平均值±标准差”表示，数据用JMP Pro 14软件进行分析，通过Design-Expert 8.0.6进行响应面优化设计，采用Origin 2021作图。

2 结果与分析

2.1 白贝肉水解蛋白酶的选择

酶具有高效性和专一性，不同蛋白酶的作用位点不同，导致对蛋白的水解能力也不同。木瓜蛋白酶可以作用于香菇煮菇水，达到增鲜提味的作用[15]。中性蛋白酶是一种既包含内切酶又包含外切酶的复合蛋白酶，可用于修饰豌豆蛋白液[16-17]。菠萝蛋白酶可用于牛肉的嫩化[18]。复合蛋白酶可对牡蛎中风味物质进行研究[19]。

由图1可知，不同蛋白酶的水解能力不同，复合蛋白酶的水解度较高，达到22.20%，远高于其他4种酶(P<0.05)。因此，选择复合蛋白酶进行后续研究。

图1 不同蛋白酶对白贝肉蛋白水解能力的影响Fig.1 Effects of different proteases on hydrolysis ability of Monetaria moneta protein

2.2 复合蛋白酶解单因素实验结果

酶的催化能力随着条件的变化而变化，从温度、料液比及加酶量3个因素探讨复合蛋白酶对白贝水解能力的影响，见图2。

图2 不同条件对白贝肉蛋白水解度的影响Fig.2 Effects of different conditions on the DH of Monetaria moneta protein

2.2.1 温度对白贝肉水解度的影响

蛋白酶对温度较为敏感，合适的温度会使蛋白酶的水解能力达到最大。由图2 中a可知，蛋白酶水解能力先随温度的上升而增加，之后随着温度的上升反而减小，温度为55 ℃时水解度值达到最高，为23.70%，55～60 ℃之间水解度大幅降低；降幅相较前一个温度跨度极为显著(P<0.05)。这是因为蛋白酶对温度变化敏感，低于最适温度时，未达到最佳酶活，水解度随着温度的上升而升高；高于最适温度时，酶活性降低或部分活性丧失，水解度也随之下降。因此，选择55 ℃为优化中心点。

2.2.2 料液比对白贝肉水解度的影响

料液比的不同会导致溶质浓度的变化，因此选择合适的料液比能使酶与底物的接触更充分，反应更完全。由图2 中b可知，水解度随着料液比的减小而增大，当料液比减小到1∶4时，水解度达到25.30%，之后虽然料液比继续减小，但水解度基本趋于稳定(P>0.05)。这可能是因为当料液比较大时，底物质量浓度也高，从而影响酶的扩散。同时，随着料液比的减小，底物浓度也随之降低，当酶与底物接触完全时，水解度也不会随着料液比的减小而大幅增加。同时结合用水等成本考虑，选择料液比1∶4作为优化中心点。

2.2.3 加酶量对白贝肉水解度的影响

由图2中c可知，水解度随着加酶量的增加呈现先快速上升后逐渐平稳的趋势，当加酶量为4 000 U/g时，水解度达到26.08%且与6 000 U/g加酶量的水解度之间差异性不显著(P>0.05)。这可能是因为随着加酶量的不断增加，底物与酶分子结合的可能性增大，反应速度加快。同时酶具有专一性，只会与特定的位点相结合，当底物反应完全时，水解度不会随着加酶量的增大而增大。因此，结合生产成本选择4 000 U/g作为响应面优化中心点。

2.3 白贝肉水解度响应面优化

Box-Behnken响应面优化设计实验结果见表2，回归模型分析结果见表3。可以看出DH拟合模型的F值为37.16，对应的P值<0.01，说明模型具有高度显著性，表明其拟合度良好，拟合方程可用于模拟分析[20]。

表2 响应面优化设计及结果Table 2 Response surface optimization design and results

续 表

表3 DH响应面二次模型方差分析Table 3 Variance analysis of DH response surface quadratic model

通过Design-Expert 8.0.6得出水解度拟合方程为DH=33.18+3.91A+2.67B+1.72C-0.85AB-0.66AC+1.78BC-2.46A2-3.96B2-1.71C2。

由表3可知，所选自变量对复合蛋白酶水解度的影响较大，由F值可知，温度对水解度的影响程度最大，其次是料液比，加酶量对水解度的影响最小，水解度模型拟合系数为0.983 5，模型校正系数为0.962 3，说明该模型的拟合度和可信度较高，可用于酶解条件的分析和预测。

2.4 不同酶解时间对水解度的影响

在响应面优化条件基础上，控制酶解pH相同，设置不同梯度酶解时间，探究其对水解度的影响，结果见图3。

图3 酶解时间对水解度的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on DH

由图3可知，水解度随着时间的增加呈现先快速增加后逐渐平缓的趋势，水解度在5 h时达到42.46%后趋于稳定，与酶解7 h的水解度差异不显著(P>0.05)。这是因为随着时间的增加，底物与酶的接触机会增大，水解度也增大；随着酶解时间的继续增加，底物被消耗完全，酶只会与特定位点结合，这些部位水解完全，水解度也不会增加。

2.5 白贝肉酶解产物主要呈味物质含量分析

2.5.1 游离氨基酸含量分析

水产品中游离氨基酸有着重要的呈味作用，对其滋味有着巨大贡献。由表4可知，白贝匀浆和酶解液均分别检测出17种氨基酸。白贝匀浆中总游离氨基酸含量为23.93 mg/100 g，甜味和鲜味氨基酸总含量占游离氨基酸总量的59.63%，其中甜味氨基酸含量最高的是丙氨酸，占总量的28.00%；鲜味氨基酸含量最高的是谷氨酸，占总量的10.00%。酶解液中总游离氨基酸含量为62.17 mg/100 g，甜味和鲜味氨基酸含量占游离氨基酸总量的44.7%，其中甜味氨基酸含量最高的是丙氨酸，占总量的15.39%；鲜味氨基酸含量最高的是谷氨酸，占总量的9.8%。虽然酶解后鲜味和甜味氨基酸占比降低，但是鲜味氨基酸含量从3.03 mg/100 g上升到8.13 mg/100 g，甜味氨基酸含量上升到19.66 mg/100 g，说明酶解后不仅鲜、甜味氨基酸被释放，而且苦味氨基酸也被释放，酶解后可以增加风味，成为制备贝类风味基料的优质原料。

表4 白贝肉及其酶解物游离氨基酸含量(mg/100 g)和TAVTable 4 The content of free amino acids (mg/100 g) and TAV of Monetaria moneta and its enzymatic hydrolysates

通过各氨基酸的TAV，可直观了解各呈味氨基酸对整体滋味的贡献情况。白贝匀浆中丙氨酸的TAV最高(11.33)，其次为谷氨酸(8)，说明丙氨酸和谷氨酸对白贝匀浆的鲜味、甜味具有巨大贡献。同时酶解液中所有游离氨基酸的TAV相对于酶解前都显著提升，其中TAV最高的为谷氨酸(20.3)，其次为丙氨酸(15.95)，说明酶解更有利于呈味物质的释放，从而提升滋味。饶梦微等对菲律宾蛤仔肉不同提取物游离氨基酸含量进行了研究，发现酶解提取物中TAV最高的分别为谷氨酸和丙氨酸；司蕊等对马氏珠母贝肉不同提取物游离氨基酸含量测定发现，新鲜酶解提取物中谷氨酸、精氨酸和丙氨酸的TAV最高，与本研究的结果一致。

2.5.2 核苷酸含量分析

核苷酸是一类风味增强剂，可以与其他呈味物质协同增鲜，对水产品的风味提升有巨大作用。其中GMP、IMP和AMP是主要呈鲜核苷酸[21]。通过对鱼贝类的研究发现，ATP的分解有两种途径[22]：第一种途径是ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx，第二种途径是ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx。

由表5可知，酶解液中只检测出GMP和IMP两种核苷酸，未检测出AMP。司蕊等对马氏珠母贝肉酶解产物的呈味核苷酸进行检测，未检测出IMP，说明不同原料中呈味核苷酸种类未必相同。推断白贝ATP关联产物的主要降解途径可能主要以第一种为主；另外，可以推测出白贝酶解物中AMP含量低。鲜味核苷酸GMP和IMP的TAV都大于1，其中GMP的TAV最大(3.50)，可以推论其对酶解物的滋味贡献最大。饶梦微等对菲律宾蛤仔肉酶解后的呈味物质进行研究，发现GMP含量最高，与本研究结果一致。

表5 白贝肉酶解产物呈鲜核苷酸含量(mg/100 g)及TAVTable 5 The content of umami nucleotides (mg/100 g) and TAV of Monetaria moneta enzymatic hydrolysates

2.5.3 有机酸、有机碱含量分析

琥珀酸是贝类中呈鲜的有机酸，主要由贝类的糖原及氨基酸的降解产生；乳酸是反映机体代谢的重要指标，对鲜味具有增强作用；甜菜碱具有爽快的鲜甜味，这些物质都对滋味有特殊贡献[23]。

由表6可知，酶解液中检测出琥珀酸、乳酸和甜菜碱，且TAV均大于1，说明对滋味都有贡献，其中乳酸的TAV最高(50.72)，说明乳酸对酶解液的滋味贡献较大。钱建瑛等对文蛤酶解前后呈味物质进行分析，发现乳酸在有机酸含量中占比最高，这是文蛤味道鲜美的原因之一，与本研究的结果一致。

表6 白贝肉酶解产物有机酸、有机碱含量(mg/100 g)及TAVTable 6 The content of organic acids,organic alkali (mg/100 g) and TAV of Monetaria moneta enzymatic hydrolysates

续 表

2.5.4 无机离子含量分析

无机离子是水产品中不可或缺的辅助呈味成分，Na+对水产品中的鲜咸味具有增强作用，Cl-可以提高鲜甜味并抑制酸味，K+可以提升鲜味和整体风味，PO43-的缺失会使整体味道下降。

由表7可知，酶解液中检测出Na+、K+、Cl-、PO43-，且TAV均远大于1，说明对滋味都有贡献，其中Na+的TAV最高(28.02)，说明Na+对酶解液的滋味贡献较大。边昊等[24]对鱼露发酵过程中的呈味物质进行研究，发现Na+是对其滋味贡献最大的无机离子，与本研究的结果一致。

表7 白贝酶解产物无机离子含量(mg/100 g)及TAVTable 7 The content of inorganic ions (mg/100 g) and TAV of Monetaria moneta enzymatic hydrolysates

2.6 电子舌滋味轮廓分析

电子舌检测可以对水产品进行整体轮廓分析，电子舌检测样品的味觉值通常以参比溶液(无味点)为对照。

由图4可知，酶解液中的酸味值、苦味回味值和咸味值均小于无味点(0)，说明酶解液中无这3种滋味[25]。酶解液中的甜味值最大(12.73)，其次是苦味值(12.61)和鲜味值(9.87)，说明其具有浓郁鲜甜的特点。甜味值最大，可能是因为酶解后甜味氨基酸得到大量释放，甜菜碱对酶解液的甜味贡献巨大；鲜味值含量较高，可以推断出是游离氨基酸、鲜味核苷酸、有机酸和无机离子共同作用的结果。步营等[26]用高压辅助法酶解蓝蛤并对其进行滋味评价，电子舌分析表明，鲜味和苦味含量较高；饶梦微等对菲律宾蛤仔肉酶解后进行滋味分析，电子舌分析表明，甜味、鲜味和苦味含量较高，与本研究的结果一致。

图4 白贝肉酶解产物电子舌检测有效味觉指标雷达图Fig.4 Radar map of effective taste indexes of Monetaria moneta enzymatic hydrolysates detected by electronic tongue

3 结论

本研究通过酶解法制备白贝肉的酶解产物并优化其酶解工艺，最佳酶解工艺为：采用复合蛋白酶，加酶量4 586 U/g、料液比1∶4.4、酶解温度58 ℃，水解度达35.58%，且酶解5 h时水解度最高，达到42.46%。白贝肉的酶解产物中鲜味和甜味氨基酸总含量占游离氨基酸总量的44.70%，鲜味核苷酸、有机酸、甜菜碱、无机离子等呈鲜物质的TAV均大于1，说明这些物质对酶解产物中的鲜味具有较大贡献。电子舌味觉特征分析表明，酶解产物中鲜甜味和苦味特征明显。综上，白贝肉的酶解产物呈味物质丰富，具有较强的鲜甜味，可为白贝天然海鲜调味料的开发提供理论指导。