GC-MS/MS法测定水产品中己烯雌酚衍生化条件研究

金丽琼，张 睿，刘 妤，杨 静

(甘肃省分析测试中心,甘肃兰州 730000)

己烯雌酚是添加在饲料中促进鱼类的生长属激素类药物，因此被作为饲料添加剂而广泛使用。随着人们对食品安全的重视，越来越多的研究发现水产品中的己烯雌酚残留物会导致生物机体代谢紊乱、发育异常或产生肿瘤等危害，是一种致癌物质[1-2]。由于生物富集作用，大量使用激素药物，对环境也会产生不利影响。因此国内外开始在食用性动物饲养中将己烯雌酚列为禁用品，2002年我国农业部发布176号公告禁止在畜禽水产养殖过程中使用己烯雌酚[3]，绿色食品标准对水产品中要求己烯雌酚不得检出[4]。

目前水产品中己烯雌酚的检测方法有：①农业部1163号公告-1—2009《动物性食品中己烯雌酚残留检测 酶联免疫吸附测定法》[5]，该方法检出限为2 μg/kg，己烯雌酚的添加浓度水平在3～12 μg/kg时，回收率为60%～110%；②行业标准SC/T 3020—2004《水产品中己烯雌酚残留量的测定 酶联免疫法》[6]，该方法检出限为0.6 μg/kg，回收率≥70%；③农业部1163号公告-9—2009《水产品中己烯雌酚残留量检测 气相色谱-质谱法》[7]，该方法检出限为0.5 μg/kg，己烯雌酚的添加浓度为0.5～10.0 μg/kg时，回收率≥70%。己烯雌酚沸点为407 ℃，超出了色谱柱的使用温度上限(325 ℃)，并且由于己烯雌酚极性较大，会吸附在色谱柱上，对色谱柱有一定的损害，因此需要将己烯雌酚衍生化生成低极性、易气化的硅烷化衍生物[8]，再用GC-MS/MS检测，因此衍生化的效果直接影响检测结果。目前现行标准中己烯雌酚的检测方法以气相色谱-质谱法为主，因此该试验通过对气相色谱-质谱法检测水产品中己烯雌酚衍生条件进行正交试验优化，简化前处理过程，减少有机试剂的污染，建立水产品中己烯雌酚的快速、绿色的检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1试验样品。鳟鱼样品，超市购买。

1.1.2试剂。甲醇、正己烷、吡啶、乙腈、乙酸乙酯，色谱级，瑞典欧普森公司；无水乙醚、无水碳酸钠，分析纯，上海国药集团；衍生化试剂N-O-双-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)/三甲基氯硅烷(TMCS)体积比99∶1，上海安谱实验科技股份有限公司；己烯雌酚标准品(1 000 μg/mL)，上海安谱实验科技股份有限公司。SLH固相萃取柱，500 mg，6 mL。

1.1.3主要仪器。赛默飞三重四级杆气相色谱串联质谱联用仪，TSQ Quantum XLS，离子源类型为EI，美国Thermo Fisher Scientific 公司；电子天平，ME2002/02型，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；恒温氮吹装仪，JRA-12YW型，无锡杰瑞安仪器设备有限公司；样品瓶，2 mL，美国Thermo Fisher Scientific公司。涡旋混合器，MX-S型，美国塞洛捷克公司；高速冷冻离心机，湘仪H-2050R型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；旋转蒸发仪，RE100-Pro，大龙兴创实验仪器(北京)股份公司；固相萃取装置，57101-U，美国SUPELCO公司。

1.2 试验方法

1.2.1样品前处理过程。取水产品可食用部分充分匀浆→称取样品→有机试剂提取→40 ℃下旋转蒸发至干→有机试剂溶解→固相萃取小柱净化→衍生化试剂衍生后上机待测。

1.2.2样品的提取与净化。50 mL离心管中称取5 g试样(精确到0.01 g)，加入乙酸乙酯20 mL，涡旋1 min后7 000 r/min 离心10 min。取上层乙酸乙酯溶液于100 mL梨形瓶中，再加入15 mL乙酸乙酯重复提取1次，合并2次乙酸乙酯提取液。40 ℃下旋转蒸发至干，用1 mL正己烷溶液溶解残留物，待净化。

依次用5 mL正己烷、5 mL乙酸乙酯活化SLH固相萃取柱，取备用液过柱，依次用2 mL正己烷、2 mL乙酸乙酯溶液淋洗小柱，弃淋洗液，将固相萃取柱抽干，依次用10 mL正己烷、乙酸乙酯洗脱，收集于50 mL离心管，40 ℃水浴氮吹干。用1.0 mL正己烷溶解残留物，转移至样品瓶中，氮气吹干，用2.0 mL正己烷复溶，待衍生[9]。

1.2.3衍生化条件的单因素试验。样品经过提取、净化后，在样品瓶中加入衍生化试剂N-O-双-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)/三甲基氯硅烷(TMCS)(体积比99∶1)，涡旋混匀，在一定温度下进行衍生化，再氮气吹干，用1.0 mL正己烷定容，用气相色谱-质谱仪(GC-MS/MS)分析。

在现有标准方法和前期试验的基础上，称取5 g试样(精确到0.01 g)置于50 mL具塞塑料离心管中，分别以乙酸乙酯为提取试剂，选取SLH固相萃取小柱净化样品，衍生化试剂添加量40、50、60、70、80、90、100 μL，衍生化温度40、50、60、70、80、90、100 ℃，衍生化时间10、20、30、40、50、60、70 min，进行单因素试验，研究这3个因素对水产品中己烯雌酚残留量的提取效率的影响，均设置3个平行。

1.2.4衍生化条件的正交试验。以单因素试验结果为基础，选取衍生化试剂添加量、衍生化温度、衍生化时间3个因素进行正交试验，每个因素设计3个水平，研究这些因素对水产品中己烯雌酚残留量的提取效率的影响，均设置3个平行。

1.2.5气相色谱-质谱条件。色谱柱型号为Thermo TR-PESTICIDE Ⅱ(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升温程序：40 ℃保持1.5 min，以25 ℃/min上升至90 ℃保持1.5 min, 以25 ℃/min上升至180 ℃保持1.5 min,然后以5 ℃/min上升至280 ℃，最后以10 ℃/min上升至300 ℃保持5 min。进样口温度270 ℃；载气为高纯氦气(99.999%)；流速1.2 mL/min；进样量1 μL；进样方式为不分流进样；溶剂延迟4.00 min。离子源温度250 ℃；传输线温度280 ℃；扫描方式为选择离子模式(SIM)；己烯雌酚正反式衍生物监控离子(m/z)383、397、412、413。己烯雌酚衍生物EI离子源总离子流图和质谱图见图1。

图1 己烯雌酚衍生物EI离子源总离子流图(a)和质谱图(b)Fig.1 Total ion current diagram (a) and mass spectrum diagram (b) of diethylstilbestrol derivative EI ion source

1.2.6方法线性考察。取己烯雌酚标准品，用衍生化试剂衍生后，上机检测，建立0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL标准溶液工作曲线，结果显示(图2)，标准溶液浓度在0.2～1.0 μg/mL呈良好的线性关系(R2>0.991 5)。

图2 己烯雌酚标准曲线Fig.2 Standard curve of diethylstilbestrol

2 结果与分析

2.1 衍生化条件的单因素试验

2.1.1衍生化试剂添加量对衍生化效率的影响。提取与净化过程不变，在衍生化温度为80 ℃、衍生化时间为30 min的条件下，不同的衍生化试剂添加量对回收率的影响见图3。从图3可以看出，随着衍生化试剂添加量增加，衍生化效率提高，但是添加量超过80 μL后，衍生化效果趋于平缓。因此最佳衍生化试剂添加量为80 μL，正交试验的衍生化试剂添加量确定在70、80、90 μL。

图3 衍生化试剂添加量对衍生化效率的影响Fig.3 Effect of addition amount of derivatization reagent on derivatization efficiency

2.1.2衍生化温度对衍生化效率的影响。提取与净化过程不变，在衍生化试剂添加量为80 μL、衍生化时间为30 min的条件下，不同的衍生化温度对回收率的影响见图4。从图4可以看出，在40～80 ℃时随着衍生化温度的升高，衍生化效果有明显提高，但是80 ℃以后，随着温度的升高，衍生化效果反而下降。因此最佳衍生化温度为80 ℃，正交试验的衍生化温度确定在60、70、80 ℃。

图4 衍生化温度对衍生化效率的影响Fig.4 Effect of derivatization temperature on derivatization efficiency

2.1.3衍生化时间对衍生化效率的影响。提取与净化过程不变，在衍生化温度为80 ℃、衍生化试剂添加量为80 μL的条件下，不同的衍生化时间对回收率的影响见图5。从图5可以看出，随着衍生化时间的延长，衍生化效果明显提高，超过30 min以后，影响不再显著，因此为了节省样品检测时间，最佳衍生化时间为30 min,将正交试验的时间确定在10、20、30 min。

图5 衍生化时间对衍生化效率的影响Fig.5 Effect of derivatization time on derivatization efficiency

2.2 衍生化条件的正交试验从表1可以看出，影响衍生化效果的各因素主次为A>B>C，即衍生化时间对衍生化效果的影响最大，其次是衍生化温度，衍生化试剂添加量的影响最小。方差分析结果表明，因素A的P<0.01，R值大于其他2个因素，说明衍生化时间对试验结果的影响极显著；因素B的P<0.05，即衍生化温度对试验结果的影响显著。按照各因素对试验的影响大小，最终确定的最优工艺条件是A3B3C1，即衍生化时间为30 min，衍生化试剂添加量为70 μL，衍生化温度为80 ℃。

表1 正交试验结果

2.3 方法的灵敏度在空白样品中己烯雌酚为未检出的前提下，取浓度为0.01 μg/mL己烯雌酚标准溶液250 μL，添加到5 g的样品中，经过样品前处理过程后测定，发现该方法的定量限为0.5 μg/kg。

2.4 方法的准确度和精密度根据我国现行的相关法律法规，在水产品的养殖过程中不允许使用己烯雌酚，因此在水产品中己烯雌酚残留量是不得检出，现行标准中定量限为0.5 μg/kg。对鳟鱼样品分别添加浓度为0.5、5.0、10.0 μg/kg的标准品进行添标回收率试验，结果发现(表2)，回收率在70.6%～92.7%，满足试验要求[10]。

3 结论与讨论

截至目前，水产品中己烯雌酚残留的国家标准检测方法主要有酶联免疫吸附测定法和气相色谱-质谱法。酶联免疫吸附测定法主要应用于大批量的阳性样品的筛查，检测出阳性样品时还需要用气相色谱-质谱法进一步确认。因此参考现有标准方法和单因素试验数据的基础上，选用乙酸乙酯进行提取，SLH固相萃取小柱，进行样品净化；以简化前处理过程和减少有机试剂的使用为目的，通过正交试验得到较优的己烯雌酚衍生化试验的条件，即衍生化试剂添加量为70 μL，衍生化温度为80 ℃，衍生化时间为30 min。