黄芩提取物的抑菌作用及稳定性研究

宋军霞,祁红兵，颜思宏

(1.岭南师范学院地理科学学院，广东湛江 524048；2.岭南师范学院生命科学与技术学院，广东湛江 524048)

近年来，随着免疫功能下降人群的不断增多，细菌、真菌感染率大幅上升，伴随耐药现象的出现，临床可供选择的抗菌药物越来越有限[1]。黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)作为中医中比较常见的一味中药，不仅有着较强的抑菌作用，而且黄芩对有耐药性的细菌也有较好的抑菌作用，如对耐药性大肠杆菌的抑菌效果明显优于侧柏叶、大蓟、艾叶、石菖蒲、夏枯草5种中草药的提取物[2]。

黄芩是传统的中药，但其生理保健功能却越来越引起人们的重视，中国药监部门认定黄芩为药食两用植物，可作为保健食品的主要成分[3-4]，《神农本草经》中曰:黄芩主诸热黄疸，肠泄痢，逐水下血闭，恶疮疽蚀火肠。黄芩也被称为山茶根、黄芩茶，为唇形科植物，多年生草本，主根长大，略呈圆锥状，外皮褐色，该药物主要具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等作用[5-8]，常用于湿温、暑温胸闷呕恶、湿热痞满、泻痢、黄疸、肺热咳嗽、高热烦渴、血热吐衄、痈肿疮毒、胎动不安等[9-13]。现代药理学的相关研究表明，黄芩具有抗氧化、抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗变态反应、抗血小板聚集及抗凝、降血脂等作用[14-18]。

有研究表明，100%黄芩浸出液滤纸片对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型链球菌都有明显的抑菌作用[19]。纯化后的多糖对大肠杆菌的抑制活性最强,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的最小抑菌浓度分别为0.625、0.625、1.250 mg/mL[20]。黄芩有效成分黄芩苷对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为1.56 g/L，且黄芩苷的抑菌能力高于黄芪皂苷[21]；蒋献等[22]研究了黄芩浸膏和一清胶囊(主要成分是黄芩)对表皮葡萄杆菌(Staphylococcusepidermidis,Se)和痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes,Pra)的体外抑菌作用，结果发现，黄芩浸膏和一清胶囊对Se和Pra的MIC均分别为1.00、0.98 g/L， 表明黄芩对Se和Pra均有显著的抑菌效果。该研究选用同一产地的黄芩，采用系统分离法对其有效化学成分进行提取，针对其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活性抑制作用效果进行比较分析，旨在对中药黄芩的有效化学成分及其抑菌作用进行分析，使临床充分了解黄芩的有效成分及抑菌作用效果，更好地为广大民众服务。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1试材。黄芩饮片，购自湛江大参林连锁店；大肠杆菌菌株、金黄色葡萄球菌菌株，岭南师范学院微生物实验室保存。

1.1.2仪器。FA2004B电子天平，上海天美天仪器有限公司；GFL-23电热恒温鼓风干燥箱，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；HH.S21-8-S电热恒温水浴锅，上海新苗医疗器械制造有限公司；LDZM-80KCS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械有限公司；THZ-100恒温培养摇床，上海一恒科学仪器有限公司；YRE-5299 旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司；PHS-3C 精密酸度计，上海天达仪器有限公司；SW-CJ-IBu超净工作台，苏州净化设备有限公司；SPL-250生化培养箱，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司。

1.1.3试剂。蛋白胨、牛肉膏、琼脂，北京奥博星生物技术有限责任公司；石油醚，分析纯，广东光华科技股份有限公司；三氯甲烷，分析纯，衡阳市凯信化工试剂有限公司；乙酸乙酯，分析纯，天津市光复精细化工研究所；正丁醇，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；柠檬酸、氢氧化钠，分析纯，成都市科龙化工试剂厂。

1.2 试验方法

1.2.1菌液和培养基的制备。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基加热至全溶，分装封瓶口后高温高压蒸汽灭菌备用。半固体培养基除了琼脂的量减少50%以外，其余与固体培养基相同。

将各供试菌在其对应的试管斜面培养基上活化，保存在4 ℃冰箱中，用时移种至新鲜琼脂斜面上，37 ℃温度培养24 h，用2～3 mL无菌水洗下菌苔。将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的新鲜培养物制成菌液。

1.2.2黄芩水提物的系统分离物的抑菌作用。

1.2.2.1黄芩水提液的制备。取黄芩100 g，加水2 L，浸泡30 min后煎煮，煮沸后文火煎30 min，过滤。药渣加水1 L，按上述方法进行再次操作后，过滤药液，合并2次滤液。离心去除掉液体里的药物残渣，用旋转蒸发仪浓缩至100 mL。置于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2.2黄芩水提液中有效成分的分离。采用系统分离法[23]对水提液进行萃取分离。依次用有机溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取进行萃取，重复3次，所得的萃取液各自合并，再加上萃余项，分别用旋转蒸发仪浓缩成浓度为0.5 g/mL。置于0～4 ℃冰箱中备用。

1.2.2.3抑菌作用。每种萃取物各取9支试管，用二倍稀释法[24]建立浓度梯度。每支试管中有效成分的浓度依次为0.500、0.250、0.125、0.063、0.032、0.016、0.008、0.004、0.002 g/mL。

根据马永全等[25]的方法。操作前将装有融化好的半固体培养基的锥形瓶置于55 ℃的恒温水浴锅中保温，加入3 mL菌液混匀；取定量半固体培养基-菌液混合物覆盖于固体培养基表面，凝固后进行后续操作。待凝固后将1 mL的移液枪头倒扣于半固体培养基上进行打孔，每皿4孔，每孔注入0.05 mL黄芩各萃取物，空白对照注入等量对应的萃取剂或无菌水。在37 ℃的恒温培养箱中培养，精确测量抑菌圈直径。

1.2.3黄芩各萃取物抑菌作用及稳定性研究。

1.2.3.1光照对黄芩水提液抑菌能力的影响。根据Wu等[26]的方法，取部分黄芩水提液分成4等份，1份置于超净工作台上，打开紫外灯照射2 h；1份置于另一超净工作台上，打开白炽灯照射2 h；1份置于晴天太阳光下直射2 h；最后一份用5层报纸包好作对照组，置于工作台上2 h。用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作指示菌，测量并比较抑菌圈大小。

1.2.3.2pH对黄芩水提液抑菌能力的影响。取部分黄芩水提液分成6等份，用柠檬酸和NaOH溶液调节黄芩水提液的pH分别为4、5、6、7、8、9，相应pH的无菌水溶液作对照，用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作指示菌，测量并比较抑菌圈大小。

1.2.3.3温度对黄芩水提液抑菌能力的影响。取部分黄芩水提液分成2等份，分别置于28和4 ℃黑暗条件下储藏。每隔10 d进行一次抑菌试验，用大肠杆菌作指示菌，测量并比较抑菌圈大小。

1.3 数据处理与分析采用Excel 2010进行试验数据的整理、统计与作图；用SPSS 17.0统计软件进行数据统计分析，用单因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD法进行多重比较以及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 黄芩各萃取物的最低抑菌浓度由表1可见，各萃取物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为石油醚0.032 g/mL、氯仿0.063 g/mL、乙酸乙酯0.032 g/mL、正丁醇0.016 g/mL、水0.063 g/mL。由表2可见，各萃取物对大肠杆菌的最低抑菌浓度分别为石油醚0.032 g/mL、氯仿0.063 g/mL、乙酸乙酯0.032 g/mL、正丁醇0.032 g/mL、水0.125 g/mL。结果显示正丁醇萃取物对2种菌的抑菌效果最强，其他萃取物均有抑菌效果。黄芩中的主要有效成分为黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷等苷类化合物，此类化合物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有明显的抑菌作用。黄芩素等水溶性苷类化合物大量存在于水层中，并被正丁醇萃取。黄芩及其有效成分具有广谱的抗菌作用。可能是各有效成分的极性不同而被不同的溶剂萃取，不同的有效成分抗菌效果不同。

表1 黄芩各萃取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径

表2 黄芩各萃取物对大肠杆菌的抑菌圈直径

2.2 不同萃取物抑菌效果的显著性分析为了研究不同萃取物对细菌的抑制情况，取浓度为0.500 g/mL的黄芩各萃取液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果进行显著性分析(P<0.05)，检验结果如表3～4所示。

从表3可以看出，黄芩各萃取物中，正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，与石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水萃取物的抑菌效果比较均有显著差异；氯仿与水萃取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较差；石油醚和乙酸乙酯萃取物的抑菌效果处于正丁醇和氯仿之间，石油醚对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比乙酸乙酯的抑菌效果强，且具有显著差异。

表3 黄芩各萃取物对金黄色葡萄球菌抑菌效果的显著性分析

从表4可以看出，黄芩各萃取物中，正丁醇萃取物对大肠杆菌的抑菌作用最强，与氯仿和水萃取物的抑菌效果比较均有显著差异，而与石油醚和乙酸乙酯萃取物的抑菌效果无显著差异；水萃取物对大肠杆菌的抑菌效果最差，氯仿萃取物对大肠杆菌的抑菌效果比水萃取物的强，与水萃取物的抑菌效果有显著差异；石油醚和乙酸乙酯萃取物的抑菌效果处于正丁醇和氯仿萃取物之间，石油醚萃取物对大肠杆菌的抑菌效果比乙酸乙酯萃取物的抑菌效果强，但无显著差异。

从表3和表4可看出，正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比其他相萃取物的抑菌效果强且较为明显，而正丁醇萃取物对大肠杆菌的抑菌效果比氯仿和水萃取物的抑菌效果强且明显，比石油醚和乙酸乙酯萃取物的抑菌效果强却不明显。由此可见，正丁醇对2种菌的抑菌作用均较强，可以从黄芩中提取并制成高效的抑菌类药物，其中对金黄色葡萄球菌一类的革兰氏阳性菌抑菌作用较强；而其他萃取物的抑菌作用较差，但也可制成低效的抑菌类药物进行合理利用，其中石油醚和乙酸乙酯萃取物对大肠杆菌的抑菌作用与正丁醇萃取物的相差不大，可制成对大肠杆菌的高效抑菌类药物。

表4 黄芩各萃取物对大肠杆菌抑菌效果的显著性分析

2.3 黄芩水提液抑菌能力的稳定性分析

2.3.1光照对黄芩水提液抑菌能力的影响。由图1可知，太阳光、紫外光和白炽灯光的照射使黄芩水提液的抑菌能力均有所降低，其中白炽灯光的照射对黄芩水提液的抑菌能力几乎没有影响，太阳光的照射对黄芩水提液的抑菌能力有一定影响，紫外光次之，但几种因素之间并没有显著差异。

图1 不同光源的照射对黄芩水提液抑菌能力的影响Fig.1 Effect of irradiation with different light sources on bacteriostatic ability of aqueous extract of Radix Scutellariae

2.3.2pH对黄芩水提液抑菌能力的影响。由图2可知，当pH≤7时，黄芩水提液的抑菌能力随着pH的升高而降低。当pH>7时，黄芩水提液抑菌能力急剧下降。可能是碱性条件下黄芩水提液的有效成分如黄芩素等不稳定，被氧化而失去抑菌能力的缘故。

图2 pH对黄芩水提液抑菌能力的影响Fig.2 Effect of pH on the antibacterial ability of aqueous extract of Radix Scutellariae

2.3.3温度对黄芩水提液抑菌能力的影响。由图3可知，随着储藏时间的延长，黄芩水提液的抑菌能力逐渐减弱。其中28 ℃储藏下的黄芩水提液的抑菌能力减弱趋势较为明显。可能是水提液中有效成分与空气中的氧气发生作用，丧失抑菌能力，有效成分含量减少，使黄芩水提液的总体抑菌能力减弱。28 ℃下储藏的黄芩水提液中有效成分与氧气反应的速率较4 ℃的快，有效成分的含量减少速率快，使黄芩水提液的总体抑菌能力减弱得快。但在20 d内，两者并没有显著差异。

图3 温度对黄芩水提液抑菌能力的影响Fig.3 Effect of storage at different temperatures on the bacteriostatic ability of aqueous extract of Radix Scutellariae

3 结论

该试验采用系统分离法对黄芩水提液进行系统分离，获得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物，并将各萃取物进行抑菌作用比较分析。结果表明，各萃取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑菌作用，抑菌作用从大到小依次为正丁醇>石油醚>乙酸乙酯>氯仿>水。同时，各萃取物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用比大肠杆菌的抑菌作用稍强。

黄芩水提物在不同环境条件下的抑菌能力试验结果显示，黄芩水提物的抑菌能力在强光易减弱，可能是少部分有效成分因降解而失去药效；黄芩水提物的抑菌能力在碱性条件下易减弱，可能是碱性条件下有效成分不稳定，被氧化而失去抑菌能力；黄芩水提物的抑菌能力在室温环境下比低温较易减弱，可能是较高温度是有效成分的氧化速率加快。因此，在制作和储藏黄芩水提物类抑菌药品时，建议在酸性、避光和低温环境下进行。