miR-146a-5p对HepG2细胞炎症反应因子IRAK-1表达的影响

孙雅楠　尹明洁　米颖　李斯

【摘要】  目的  检测miR-146a-5p对肝HepG2细胞白介素受体相关激酶-1（IRAK-1）表达的作用，以及在牙龈卟啉单胞菌P.gLPS（P.gLPS）诱导的细胞炎症反应下，miR-146a-5p对IRAK-1的作用。方法  通过细胞培养、P.gLPS刺激以及miR-146a-5p-mimics转染、细胞蛋白提取及蛋白免疫印迹法等方法，检测HepG2细胞miR-146a-5p转染组（A组）、P.gLPS刺激组（B组）、miR-146a-5p转染+P.gLPS刺激组（C组）以及阴性对照组，比较各组IRAK-1 mRNA及蛋白变化。结果  四组IRAK-1蛋白表达水平结果显示，A组水平最低，B组水平最高，组间差异存在意义（P<0.05）。进一步两两比较结果显示，除了阴性对照组与C组之间差异无统计学意义（P>0.05）外，其他各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。结论  miR-146a-5p能够抑制HepG2细胞IRAK-1蛋白表达，在炎症反应过程中miR-146a-5p通过抑制IRAK-1的表达发挥抑制炎症反应的作用。

【关键词】  microRNA-146a-5p；HepG2细胞；牙龈卟啉单胞菌；白介素受体相关激酶-1；实时荧光定量PCR；免疫印迹试验

中图分类号  R575.5    文献标识码  A    文章编号  1671-0223（2023）07--03

HepG2细胞是人肝癌细胞株，其表型及细胞功能与肝细胞相似，具有肝细胞所特有的生物学特性，如脂质代谢、炎症反应、糖调节及RNA的合成等，目前在肝细胞相关的脂代谢、炎症反应及能量代谢等研究中被用来建立肝细胞模型[1-3]。小分子核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类存在于人体循环系统中并且能够调节生理病理反应的重要因子，其中miR-146a-5p在人类免疫调节功能中具有重要的作用。研究显示，细胞中、组织液中以及血浆中的miR-146a-5p具有抑制炎症反应，防止炎症反应放大的作用[4-5]。白介素受体相关激酶-1（interleukin receptor-associated kinase-1，IRAK-1）是一类炎症反应调节因子，在机体自身免疫过程中通过调整炎症因子的表达量[6-7]激活氧化应激反应等作用，具有加重炎症反应，影响人体正常的生理作用。但是miR-146a-5p是否对HepG2细胞中的炎症调节因子IRAK-1表达水平产生影响，以及在牙龈卟啉单胞菌（porphyromonas gingivalislipopolysaccharide，P.gLPS）刺激细胞炎症反应中，miR-146a-5p是否仍能发挥一定的抑制炎症反应的作用未见报道。因此，本研究通过转染miR-146a-5p HepG2细胞以及P.gLPS刺激后的HepG2细胞，观察IRAK-1蛋白表达水平，阐明miR-146a-5p对细胞炎症反应的影响。

1  资料与方法

1.1  实验分组

本实验的HepG2细胞系由中国协和医科大学基础研究所细胞中心所提供，分为4组：①阴性对照组：单纯细胞培养，无转染及炎症刺激，培养条件与各组相同；②A组：细胞经miR-146a-5p mimics细胞转染；③B组：细胞经P.gLPS刺激；④C组：细胞经miR-146a-5p-mimics转染及P.gLPS刺激。

1.2  细胞培养

将液氮中冻存的细胞在试管中进行复苏，在复苏后的细胞试管中沿管壁逐步轻柔加入一定的DMEM培养液，进一步将复苏后的细胞稀释，浓度为105/ml。将细胞轻柔转移至干燥的培养瓶中，并且在CO2培养箱内再次培养，CO2浓度为37%，在细胞培养过程中通过显微镜观察细胞，如观察到细胞生长活跃，至铺满整个瓶壁，可进行细胞的传代。

1.3  细胞转染及炎症刺激

1.3.1  细胞转染  用吸管轻柔的吸取250μl miR-146a-5pmimics转染复合物，将其缓慢加入到细胞孔板中，进一步吸取Opti-MEM培养基，按照750μl/孔的量加入，轻柔混合均匀。设定培养箱的培养条件为温度37℃、CO2浓度5.0﹪、饱和湿度，培养24h。经转染6h后，吸取1ml普通DMEM培养基缓慢的加入各培养孔。

1.3.2  炎症刺激  B组与C组在实验中分别加入P.gLPS的浓度为1μg/ml，在培养6h后收获细胞，并用于后续的蛋白检测实验。

1.4  Western blot细胞内蛋白的检测

细胞在经过转染清洗之后，进一步应用RIPA裂解上述实验处理过的细胞，并获得实验细胞内的总蛋白。应用考马斯亮蓝法进一步测定所提取的蛋白浓度行SDS-PAGE电泳。取目的蛋白条带，在恒流电为200毫安的电流下进行转膜1h。转膜完成后，将膜用TBST水清洗，进一步进行封闭实验：将膜轻柔放于封闭液中，并在摇床上进行封闭1h。配制一抗体与一抗稀释液（比例为按1∶100或1∶200），將封闭好的膜首先放入一抗稀释液，4℃摇床过夜。配制二抗与二抗稀释液（按1∶1000或1∶2000的比例），之后将膜放入配好的二抗稀释液，在常温的条件下，将膜轻柔放在摇床上摇3h。在二抗孵育实验完成之后，用TBST清洗3次，进一步加入显色液，并在凝胶成像系统中进行显色，记录实验结果。

1.5  数据处理方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，P<0.05为差异有统计学意义。正态分布的计量资料使用“±s”表示，四组均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD方法检验。

2  结果

2.1  各组HepG2细胞IRAK-1蛋白表达水平比较

四组IRAK-1蛋白表达水平结果显示，A组水平最低，B组水平最高，组间差异有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较结果显示，除了阴性对照组与C组之间差异无统计学意义（P>0.05）外，其他各组间差异均有统计学意义（P<0.05），见表1、图1。

3  讨论

miRNA是一类非编码的小RNA分子，在人體的生长发育、炎症反应、细胞功能及细胞生存周期的调节中发挥重要作用。miRNA稳定的存在于机体细胞中、组织液中以及血浆中，能够调节蛋白的表达，在病理生理情况下，细胞中的miRNA因消耗会表达减少，也会因细胞凋亡等机制释放如血浆[8-9]，通过对miRNA功能的研究能够明确阐述细胞炎症反应及细胞功能异常的机制。

miR-146a-5p是miRNA成员之一，研究表明在机体炎症反应过程中，其具有免疫调节的作用，发挥抑制炎症的作用[10-11]。研究证实，在炎症反应过程中，其表达水平能够发生显著变化，通过分子研究表明，其在抗炎方面作用显著，包括促进炎症修复，以及抑制慢性炎症作用[12-13]。研究证实，高糖环境下机体长期处于慢性的低度炎症反应状态，炎症反应过程能够加速线粒体的损伤并进一步促进胰岛细胞的凋亡，同时减少胰岛素分泌引起患者高血糖的发生。炎症还能够减少外周肌肉及脂肪组织对于糖的代谢及利用，使机体产生胰岛素抵抗[14]。还有实验在糖尿病模型小鼠的胰岛细胞内进行，研究显示高糖环境下小鼠胰岛细胞内miR-146a-5p的表达水平显著高于非糖尿病小鼠模型，进一步证实了在炎症刺激情况下，miR-146a-5p的过量表达是进一步发挥抑制炎症反应的作用。

IRAK-1是一类炎症反应因子，具有放大和扩大炎症反应的作用，人IRAK-1基因位于Xq28位点，在细胞炎症免疫过程中通过激酶激活一系列炎症因子，并且诱发下游炎症因子产生瀑布式的炎症级联反应，造成细胞产生严重的炎症，影响细胞功能并产生组织损伤[16]。国外的研究显示，在IRAK-1基因敲除小鼠进行试验，发现敲除后小鼠脓毒血症及脑髓炎这类炎症反应的发生率降低，进一步证明小鼠体内IRAK1因子降解是机体防止炎症反应过度表达的非常重要的防护调节机制，在实验过程中也检测到其相关的炎症因子表达降低，证明抑制IRAK-1表达能够减缓细胞的炎症反应强度[17-18]。但miR-146a-5p是否对HepG2细胞中的IRAK-1蛋白表达产生一定的抑制作用未见报道；在P.gLPS诱导的HepG2细胞炎症反应是否IRAK-1表达水平会发生变化未见报道；在P.gLPS所诱导的HepG2细胞炎症反应中，miR-146a-5p是否仍能抑制IRAK-1蛋白表达未见报道。本研究显示miR-146a-5p能够显著抑制HepG2细胞中IRAK-1蛋白表达；P.gLPS刺激能够显著增加HepG2细胞IRAK-1蛋白表达；在P.gLPS刺激HepG2细胞产生的炎症反应中，miR-146a-5p能够通过抑制细胞IRAK-1蛋白表达发挥抑制炎症的作用。

本实验证实在肝HepG2细胞中，miR-146a-5p通过抑制IRAK-1蛋白表达发挥抑制炎症的作用，证实其在炎症反应过程中发挥重要作用，本实验为miR-146a-5p相关细胞中的作用机制研究提供理论依据。

4  参考文献

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[2022-12-26收稿]