斑籽木乙酸乙酯萃取部位的体内外抗炎作用及机制

杨锐，卢光衣，张倩茹，陈帅，何红平，蒋华夷

云南中医药大学中药学院 云南省南药可持续利用重点实验室，昆明 650500

斑籽木别名斑籽，为大戟科斑籽木属灌木，产于我国云南西南部，在亚洲南部和东南部各国亦有分布［1］。斑籽木全株均可入药，具有清热解毒、消肿止痛、泻下利尿等功效，常用于治疗支气管炎、哮喘、水肿、黄疸、麻风病和皮肤病等［2］。研究表明，斑籽木提取物具有抗肿瘤、抗过敏、抗菌、抗氧化、保肝、免疫调节等多种药理活性，而关于其化学成分的研究报道较少，已分离鉴定的化学成分主要涉及二萜、苯丙素、生物碱等结构类型［2-6］。为进一步明确斑籽木活性部位及其物质基础，2021 年8 月—2022 年1 月本研究以斑籽木地上部分为研究对象，采用角叉菜胶致小鼠足跖肿胀模型，初步评价其90%乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位（BSEA）的抗炎活性，并对BSEA 体外抗炎活性进行评价；同时，通过分子对接技术初步探讨活性成分可能的抗炎作用机制，为斑籽木在抗炎方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 斑籽木地上部分于2019 年3 月采自云南省西双版纳州，经云南中医药大学张雪梅鉴定为大戟科斑籽木Baliospermum solanifolium （Burman） Suresh，标本（BS-201903001）保存于云南省傣医药与彝医药重点实验室；角叉菜胶（美国Sigma 公司）；阿司匹林、羧甲基纤维素钠（北京索莱宝科技有限公司）。雌性ICR 小鼠［SPF 级，体质量（20 ± 2）g，斯贝福（北京）生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2019-0010］，适应性饲养4 d，环境温度为（22 ± 2）oC，湿度为40%～60%，每日光照约12 h，自由饮食和摄水。小鼠单核巨噬细胞RAW264.7（中科院上海细胞库）；DMEM 培养基和胎牛血清（以色列Biological Industries 公司）；Griess 试剂、LPS 及阳性对照药物L-NMMA 均购自日本Sigma 公司；一氧化氮（NO）检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；GF254型薄层层析硅胶板（青岛海洋化工厂）；柱色谱硅胶（80～100、100～200 目，青岛海洋化工厂）；RP-C18柱色谱填料（美国EMD Millipore 公司）；MCI（CHP20P，75～150 μm，日本三菱化学公司）；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（美国GE Healthcare公司）；色谱纯乙腈和甲醇（上海星可高纯溶剂有限公司）；工业乙醇、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇（上海泰坦化学有限公司）经重蒸后使用。NX-1R离心机（天津鼎昊源生物科技有限公司）；Varioskan FLASH 多功能酶标仪（美国Thermo 公司）；MX-S 旋涡混匀仪（北京大龙兴创实验仪器股份公司）；Caliper3 数显卡尺（东莞三量具有限公司）；Centrifuge 5804R 型冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；Synergy2 型多功能酶标仪（美国Biotek 公司）；Bruker AV-500 型核磁共振仪（德国Bruker 公司）；Hei-VAP Core HL/G3 旋转蒸发仪（德国Heidolph 公司）；Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），色谱柱为XDB-C18（9.4 mm×250 mm，5 μm，美国Agilent公司）。

1.2 BSEA体内抗炎作用观察方法

1.2.1 BSEA的制备 取干燥斑籽木地上部分20 kg适当粉碎，用90%乙醇/水浸渍提取4 次，每次3 d。合并滤液，减压浓缩至无醇味后将浸膏分散于水中，用石油醚于室温下萃取3次。水相随后用乙酸乙酯萃取4次，萃取液经减压浓缩后得到浸膏800 g。

1.2.2 动物分组、药物干预及模型制备 参照文献［7-8］方法，将48只雌性小鼠，随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组及BSEA 高、中、低剂量组。阳性对照组给予阿司匹林400 mg/kg 灌胃，BSEA 高、中、低剂量组分别给予176、88、44 mg/kg 浸膏灌胃，均以1 mL/100 g连续灌胃5 d，每天1次；模型组给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃。给药剂量根据人给药剂量换算并结合预实验结果确定。除正常对照组外，其他各组均在末次给药1 h 后，于小鼠左后足跖皮下注射1%角叉菜胶水溶液25 μL 致炎。采用游标卡尺法测定致炎后5 h 小鼠的左后足足跖厚度，并分别按下式计算足跖肿胀度和肿胀抑制率。

1.3 BSEA体外抗炎作用观察方法

1.3.1 斑籽木BSEA 化学成分的分离 斑籽木BSEA 经正相硅胶（3.5 kg，80～100目）柱色谱分离，以石油醚-丙酮（1∶0～0∶1）梯度洗脱，薄层色谱法监测，合并相同组分，得到7 个部分Fr.A～G。Fr.C（69.1 g）经硅胶柱层析（691 g，100～200目，石油醚-丙酮1∶0～0∶1 梯度洗脱）分为7 个组分Fr. C1～C7。Fr.C1经半制备HPLC（51%乙腈-水，3 mL/min）得到化合物1（6.3 mg，tR=24.7 min）。Fr. D（30.4 g）经MCI柱层析，以90%甲醇-水洗脱，得到4 个组分Fr.D1～D4。Fr.D1（13.2 g）经硅胶柱色谱（400 g，100～200 目，石油醚-丙酮50∶1～1∶1 梯度洗脱）分为8 个组分Fr.D1-1～D1-8。Fr.D1-8经半制备HPLC（15%乙腈-水，3 mL/min）得到化合物4（8.7 mg，tR=7.6 min）。Fr.E（32.9 g）经MCI 柱色谱（40%～100%甲醇-水梯度洗脱）得到3 个组分Fr. E1～E3。Fr.E2 经中压RP-18 柱层析，以40%～100%甲醇-水梯度洗脱，得到8个组分Fr.E2-1～E2-8。Fr.E2-4经硅胶柱层析（80 g，80～100 目，石油醚-乙酸乙酯20∶1等度洗脱）得到化合物2（129.8 mg）。Fr. E3 经硅胶柱层析（120 g，80～100目，石油醚-乙酸乙酯30∶1～2∶1 梯度洗脱）分为9 个组分Fr. E3-1～E3-9。Fr.E3-5 经半制备HPLC（82%乙腈-水，3 mL/min）得到化合物3（7.4 mg，tR=29.6 min）。

图1 化合物1～4的结构

1.3.2 单体化合物的体外抗炎活性检测 将RAW264.7 巨噬细胞接种至96 孔板，用1 μg/mL LPS 进行诱导刺激，同时加入待测化合物处理（终浓度从50 μmol/L 开始2 倍稀释），设置空白对照组（不含药物）和NG-甲基-L-精氨酸乙酸盐（L-NMMA）阳性对照组。细胞过夜培养后取培养基检测NO 生成，在570 nm 处测定吸光值（OD）。采用MTS 法在剩余培养基中进行细胞存活率检测，以排除化合物对细胞的毒性影响［9］。半数抑制浓度（IC50）值按Reed&Muench法计算［10］。

1.4 BSEA体外抗炎作用机制分析 利用PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），获得化合物2的sdf格式文件。根据文献［11-13］，选取5个与抗炎活性密切相关的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）、核转录因子-κB（NF-κB）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）组成靶点数据库。通过RCSB PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）搜索以上靶点对应的蛋白，下载相应蛋白的pdb 格式文件。用CB-Dock2（https：//cadd. labshare. cn/cb-dock2/php/index.php）自动计算结合位置和box的范围，然后基于AutoDock Vina执行分子对接［14-15］。

1.5 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组比较采用t检验，三组及以上比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD 法检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BSEA 的体内抗炎作用 连续灌胃给药5 d，小鼠未出现异常，表明受试样品在实验所设定的剂量条件下对小鼠的正常生命活动无影响。模型组、阳性对照组及BSEA 高、中、低剂量组致炎5 h 足肿胀度 分 别 为（29.52 ± 3.14）%、（16.07 ± 1.61）%、（19.02 ± 3.63）%、（21.48 ± 2.45）%、（25.33 ± 4.93）%。与模型组比较，阳性对照组、BSEA 高剂量组、BSEA 中剂量组足肿胀度低（P均＜0.05）；与阳性对照组比较，BSEA 中、低剂量组足肿胀度高（P均＜0.05），而高剂量组足肿胀度与阳性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。阳性对照组及BSEA 高、中、低剂量组肿胀抑制率分别为45.56%、35.57%、27.24%、14.19%。

2.2 BSEA 的体外抗炎作用 从斑籽木BSEA 中分离得到4 个化合物，分别鉴定为2，3-反式-6，7，4′-三甲氧基黄烷醇（1）［16］、α-亚麻酸（2）［17］、亚麻酸甲酯（3）［18］、甘油亚麻酸酯（4）［19］。化合物2 在50 μmol/L 浓度下对细胞生长无影响，细胞存活率＞90%。进一步对化合物2 进行NO 生成抑制活性评价，结果显示化合物2 在50 μmol/L 浓度下的NO 生成抑制率为（82.52 ± 0.54）%，IC50值为（22.79 ± 1.48）μmol/L，其抑制活性优于阳性对照药L-NMMA［NO 生成抑制率为（57.42 ± 1.41）%，IC50值为（33.74 ± 2.13）μmol/L］。

2.3 BSEA 的作用机制 分子对接结果显示，化合物2 与iNOS、PPARα、NF-κB、IL-1β 和TNF-α 的结合能分别为-7.3、-6.7、-6.4、-6.2、-5.9 kCal/mol，提示其可能通过以上5 个靶标发挥抗炎作用。化合物2 的C-1 位羰基氧与iNOS 的Tyr-483 氨基酸残基形成氢键作用，18-CH3与Tyr-485 残基形成π-σ 作用，与Met-349、Leu-119 残基形成Alkyl-Alkyl 作用，与Phe-482 残基形成π-Alkyl 作用；C-1 位羟基与PPARα 的His-274 残基形成氢键作用，18-CH3与Cys-275、Ile-272、Val-332、Ile-339 残基形成Alkyl-Alkyl作用；C-1位羰基氧与NF-κB 的Ser-164、Gly-163、Gly-165、Lys-166 残基形成氢键作用，C-1 位羧基H与Thr-167 残基形成氢键作用，18-CH3与Arg-204 残基形成Alkyl-Alkyl作用；C-1位羧基H和羰基氧分别与IL-1β 的Asn-129、Tyr-127 残基形成氢键作用，18-CH3与Pro-28 残基形成Alkyl-Alkyl 作用；C-1 位羧基H 和羰基氧分别与TNF-α 的Gln-125、Arg-82残基形成氢键作用，18-CH3与Tyr-87 残基形成Alkyl-Alkyl作用。见表1。

表1 化合物2的分子对接结果

3 讨论

炎症是机体受到内外侵害或感染后所发生的一种防御反应，具体表现为红、肿、热、痛甚至功能障碍［20］。通常情况下，炎症可以激活免疫系统，抵抗多种刺激，从而保护机体免受伤害或感染。但过度、长期的炎症反应可能会导致细胞损伤或代谢紊乱，进而引发一系列疾病，包括动脉粥样硬化、糖尿病、心肌梗塞、癌症以及神经退行性疾病等［21］。在炎症反应的发生和消退过程中，通常需要多种细胞和细胞因子等的参与，它们往往相互协同或拮抗，共同影响机体的免疫应答和炎症反应［22］。

NO具有广泛而重要的生物学调控功能，在炎症的发生、发展过程中起着重要作用。当免疫细胞遭受炎症介质或微生物内毒素等的刺激时，会产生大量iNOS，iNOS 通过催化L-精氨酸生成NO 进行免疫应答。因此抑制NO 生成是检测抗炎活性的直接指标。LPS 是革兰阴性菌细胞壁的主要组成成分，可诱导巨噬细胞释放炎症因子，从而引发炎症反应。将小鼠巨噬细胞RAW264.7 用LPS 诱导iNOS 的生成，同时加入待测样品处理，通过Griess 法测定培养基在570 nm 波长下的吸光值可检测亚硝酸盐［23］。因此，可通过测定样品对LPS 诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞内NO生成的抑制作用，评价其抗炎活性。

分子对接技术属于计算机辅助药物设计的重要组成部分，是将配体小分子放入受体活性口袋中，通过变化小分子配体的空间构象，按照几何、能量及化学环境互补的原则来评价配体与受体相互作用的强弱，从而预测其结合模式和亲和力的方法。近年来，分子对接技术在活性成分筛选和作用机制研究等方面有着广泛应用［24］。中国科学院昆明动物研究所黄京飞课题组利用分子对接技术，从21 940 个小分子化合物中获得了2 355 个候选抗中风药物，包括1 564个单一靶向药物和791个多靶点药物，并解释了多种抗中风植物潜在的作用机制，为抗中风药物的研发奠定了基础［25］。

本研究采用角叉菜胶致小鼠足跖肿胀模型，考察斑籽木BSEA 的体内抗炎作用。结果显示，与模型组相比，BSEA 高、中剂量组均能显著抑制角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀。同时，肿胀抑制率也表明各给药组对小鼠的足肿胀有较好的改善作用。采用多种色谱方法从BSEA中分离鉴定了4个化合物，均为首次从斑籽木属植物中分离得到，进一步加深了对斑籽木化学成分的认识。通过抗炎活性评价发现其中含量较大的化合物2具有潜在的抗炎活性。采用基于AutoDock Vina 的CB-Dock2 平台对化合物2 进行分子对接，结果表明其与炎症相关靶标iNOS、PPARα、NF-κB、IL-1β 和TNF-α 具有较好的亲和力，其中与iNOS 蛋白结合最好，该结果提示化合物2 的抗炎作用可能与以上5 个靶点相关，后续可针对该靶点进行其抗炎作用机制的研究。

本研究为斑籽木在抗炎方面的相关应用提供了一定的科学依据，并为进一步研究斑籽木抗炎药效物质基础及其作用机制提供了依据。