miR-199b-5p对阿霉素诱导足细胞凋亡的影响及机制

吴静漪

江苏盛泽医院儿科，江苏 苏州 215228

慢性肾脏病（CKD）患病率逐年增加，随着病程进展，其最终进入终末期肾病（ESRD）。蛋白尿是促进ESRD 进展的独立危险因素［1-2］，而足细胞损伤是产生蛋白尿的主要原因。足细胞凋亡可预测CKD患者蛋白尿增多和肾功能进行性下降［3］。微小RNA（miRNA）是一类内源性的高度保守的短链非编码RNA，是基因表达的主要转录后调节因子，参与多种疾病的病理生理过程［4-5］。miRNA 在肾脏疾病中发挥了重要作用，但具体机制并不清楚。越来越多的研究显示miR-199b-5p 在多种疾病进展中发挥关键作用。但miR-199b-5p 与足细胞凋亡的关系并不明确。因此，2021 年1 月—2022 年7 月，本研究拟探讨miR-199b-5p 对阿霉素诱导足细胞凋亡的影响及其机制，为CKD的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 小鼠足细胞购自上海ATCC细胞库。阿霉素购自美国MedChemExpress公司；miR-199b-5p mimic 和miR-199b-5p inhibitor 购自上海吉玛制药技术有限公司；过表达/沉默脂肪细胞质膜相关蛋白（APMAP）腺病毒购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司；野生型APMAP 3′UTR（pRL-APMAP-3′UTR WT）、突变型APMAP 3′UTR（pRL-APMAP-3′UTR MUT）质粒和转染试剂盒购自广州锐博生物技术有限公司；Podocin 抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司；Bax、Bcl-2 和GAPDH抗体购自美国Affinity Biosciences 公司；Cleaved caspase-3、NF-κB 诱导激酶（NIK）、TNF 受体相关因子3（TRAF3）和APMAP 抗体购自美国Abcam 公司；Allin-one miRNA 试剂盒购自广州易锦生物技术有限公司；HiScript Ⅲ RT SuperMix 和BCA 蛋白定量试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 细胞培养及干预 将小鼠足细胞复苏后用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、10 U/mL γ 干扰素（IFN-γ）的RPMI-1640 培养液于37 ℃含5%二氧化碳的培养箱中培养，待细胞于培养瓶中长满后，接种至12孔板或6孔板，并用不含IFN-γ 的培养基于培养箱中进行分化成熟10～14 d。取部分足细胞随机分为对照组、阿霉素组，阿霉素组取1 μL 阿霉素工作液（1 μg/mL）加入1 mL 无血清RPMI-1640培养基诱导24 h，阿霉素终浓度为1 ng/mL。

1.3 细胞转染及分组 将足细胞接种于12孔板或6孔板中，使细胞培养至40%～50%融合。为证实miR-199b-5p在阿霉素诱导足细胞凋亡中的作用，取部分细胞随机分为对照组、阿霉素组、阿霉素+miR-199b-5p mimic 组（过表达）、阿霉素+NC mimic 组，阿霉素+miR-199b-5p inhibitor 组（沉默表达）、阿霉素+NC inhibitor组并给予相应方法转染。为证实APMAP在足细胞凋亡中的作用，取部分细胞随机分为阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-APMAP 组（过表达）、阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-NC mimic 组，阿 霉 素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-APMAP RNAi组（敲低表达）和阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-NC RNAi组，分别转染过表达或敲低APMAP腺病毒，使APMAP过表达或沉默表达。

1.4 细胞内miR-199b-5p及足细胞标志蛋白（Podocin）、凋亡相关基因（Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3）、APMAP mRNA 表达检测 采用实时荧光定量PCR。用TRIzol试剂提取细胞总RNA，采用逆转录试剂盒合成cDNA，按照PCR 试剂盒说明书以cDNA 为模板进行荧光定量PCR。miR-199b-5p 反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。APMAP、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Podocin mRNA 反应条件：95 ℃ 39 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。引物序列见表1。用2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达量。

表1 各基因引物序列

1.5 细胞内Podocin、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、APMAP 及NF-κB 信号通路相关蛋白（NIK、TRAF3）表达检测 采用Western blotting 法。用RIPA 法提取细胞总蛋白，采用BCA 蛋白定量法测定蛋白浓度，将适量变性蛋白样本进行SDS-PAGE 电泳、转膜、抗原抗体反应后，在ECL 发光液和凝胶成像分析系统下显影，采用Image J 进行图像分析。一抗稀释 浓度：Podocin（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Cleaved caspase-3（1∶1 000）、APMAP（1∶1 000）、NIK（1∶1 000）、TRAF3（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）。以GAPDH 作为对照，以目的条带灰度值/GAPDH条带灰度值作为目的蛋白相对表达量。

1.6 miR-199b-5p特异性下游靶基因分析 采用生物信息学分析。通过Targetscan（http：//www. targetscan. org/）数据库寻找miR-199b-5p 的特异性下游靶基因。

1.7 miR-199b-5p直接靶基因验证 采用双荧光素酶报告基因实验。将细胞接种于24孔板中，待细胞生长至60%融合时，随机分为NC mimic+WT-APMAP组、miR-199b-5p+WT-APMAP 组、NC mimic+MUTAPMAP 组、miR-199b-5p+MUT-APMAP 组，使用转染试剂分别将构建的野生型（WT-APMAP）、突变型（MUT-APMAP）质粒、miR-199b-5p mimic、NC-mimic共培养24 h，加入细胞裂解液充分裂解细胞，按照双荧光素酶报告基因实验操作测定荧光素酶活性。

1.8 统计学方法 采用GraphPad Prism8.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组比较采用t检验；多组比较采用方差分析，进一步两两比较采用Bonferroni方法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组与阿霉素组miR-199b-5p、足细胞标志蛋白、凋亡相关基因表达比较 对照组、阿霉素组miR-199b-5p相对表达量分别为1.00 ± 0.02、1.89 ± 0.70，阿霉素组miR-199b-5p 相对表达量高于对照组（P＜0.05）。两组足细胞标志蛋白、凋亡相关基因表达比较见表2。

表2 对照组与阿霉素组足细胞标志蛋白、凋亡相关基因表达比较（¯x ± s）

2.2 过表达或敲低miR-199b-5p 对阿霉素诱导足细胞凋亡的影响 过表达miR-199b-5p 对阿霉素诱导足细胞凋亡的影响：阿霉素+NC mimic 组、阿霉素+miR-199b-5p mimic 组miR-199b-5p 相对表 达 量分别为1.00 ± 0.20、9.36 ± 0.24，阿霉素+miR-199b-5p mimic 组miR-199b-5p 相对表达量高于阿霉素+NC mimic 组（P＜0.05）。两组Podocin、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 表达比较见表3。敲低miR-199b-5p对阿霉素诱导足细胞凋亡的影响：阿霉素+NC inhibitor 组、阿 霉 素+miR-199b-5p inhibitor 组miR-199b-5p相对表达量分别为1.00 ± 0.10、0.43 ± 0.02，阿霉素+miR-199b-5p inhibitor组miR-199b-5p相对表达量低于阿霉素+NC inhibitor组（P＜0.05）。两组Podocin、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3表达比较见表4。

表3 过表达miR-199b-5p对阿霉素诱导足细胞凋亡的影响（±s）

表3 过表达miR-199b-5p对阿霉素诱导足细胞凋亡的影响（±s）

组别阿霉素+NC mimic组阿霉素+miR-199b-5p mimic组＜0.05 Podocin蛋白1.00 ± 0.22 0.51 ± 0.08＜0.05 mRNA 1.02 ± 0.01 0.45 ± 0.13＜0.05 Bax蛋白0.98 ± 0.12 1.94 ± 0.02＜0.05 mRNA 1.11 ± 0.02 1.95 ± 0.03＜0.05 Bcl-2蛋白1.00 ± 0.05 0.56 ± 0.18＜0.05 mRNA 1.01 ± 0.02 0.60 ± 0.02＜0.05 Cleaved caspase-3蛋白1.00 ± 0.02 1.88 ± 0.40＜0.05 mRNA 1.03 ± 0.60 1.76 ± 0.03＜0.05

表4 敲低miR-199b-5p对阿霉素诱导足细胞凋亡的影响（±s）

表4 敲低miR-199b-5p对阿霉素诱导足细胞凋亡的影响（±s）

组别阿霉素+NC inhibitor组阿霉素+miR-199b-5p inhibitor组P Podocin蛋白1.00 ± 0.22 1.62 ± 0.02＜0.05 mRNA 1.05 ± 0.01 1.65 ± 0.04＜0.05 Bax蛋白1.00 ± 0.04 0.45 ± 0.02＜0.05 mRNA 1.01 ± 0.02 0.55 ± 0.03＜0.05 Bcl-2蛋白1.01 ± 0.05 1.92 ± 0.50＜0.05 mRNA 1.00 ± 0.03 1.83 ± 0.02＜0.05 Cleaved caspase-3蛋白1.01 ± 0.02 0.59 ± 0.16＜0.05 mRNA 1.01 ± 0.01 0.56 ± 0.03＜0.05

2.3 miR-199b-5p 靶向APMAP 对足细胞凋亡的影响 生物信息学分析结果显示，APMAP-3′UTR 具有miR-199b-5p 高度保守的结合位点。NC mimic+WT-APMAP 组、miR-199b-5p+WT-APMAP 组、NC mimic+MUT-APMAP 组、miR-199b-5p+MUT-APMAP组荧光素酶活性分别为1.00 ± 0.10、0.53 ± 0.02、0.97 ± 0.03、1.00 ± 0.02。 与NC mimic+MUTAPMAP组比较，miR-199b-5p+WT-APMAP组APMAP的荧光素酶活性低（P＜0.05）。各组APMAP及足细胞标志蛋白、凋亡相关基因表达比较见表5～7。

表5 各组APMAP表达比较（±s）

表5 各组APMAP表达比较（±s）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与阿霉素+NC mimic 组比较，bP＜0.05；与阿霉素+NC inhibitor比较，cP＜0.05。

组别对照组阿霉素组阿霉素+NC mimic组阿霉素+miR-199b-5p mimic组阿霉素+NC inhibitor组阿霉素+miR-199b-5p inhibitor组APMAP蛋白1.00 ± 0.10 0.53 ± 0.02a 0.52 ± 0.20 0.33 ± 0.12b 0.59 ± 0.12 1.35 ± 0.23c mRNA 1.01 ± 0.02 0.45 ± 0.10a 0.56 ± 0.12 0.26 ± 0.13b 0.55 ± 0.02 1.50 ± 0.13c

表6 阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-NC组、阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-APMAP组足细胞标志蛋白、凋亡相关基因表达比较（±s）

表6 阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-NC组、阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-APMAP组足细胞标志蛋白、凋亡相关基因表达比较（±s）

组别阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-NC组阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-APMAP组P Podocin蛋白1.00 ± 0.02 1.85 ± 0.30＜0.05 mRNA 1.00 ± 0.01 1.95 ± 0.03＜0.05 Bax蛋白0.98 ± 0.12 0.45 ± 0.10＜0.05 mRNA 1.01 ± 0.02 0.52 ± 0.50＜0.05 Bcl-2蛋白1.00 ± 0.05 1.98 ± 0.40＜0.05 mRNA 1.01 ± 0.02 1.86 ± 0.12＜0.05 Cleaved caspase-3蛋白1.02 ± 0.02 0.46 ± 0.03＜0.05 mRNA 1.00 ± 0.01 0.36 ± 0.13＜0.05

表7 阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-NC组、阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-APMAP组足细胞标志蛋白、凋亡相关基因表达比较（±s）

表7 阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-NC组、阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-APMAP组足细胞标志蛋白、凋亡相关基因表达比较（±s）

组别阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-NC组阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-APMAP组P Podocin蛋白1.02 ± 0.02 0.45 ± 0.12＜0.05 mRNA 1.00 ± 0.02 0.42 ± 0.03＜0.05 Bax蛋白1.00 ± 0.13 1.88 ± 0.15＜0.05 mRNA 1.00 ± 0.02 1.90 ± 0.50＜0.05 Bcl-2蛋白1.01 ± 0.05 0.34 ± 0.10＜0.05 mRNA 1.00 ± 0.01 0.46 ± 0.02＜0.05 Cleaved caspase-3蛋白1.02 ± 0.03 1.86 ± 0.13＜0.05 mRNA 1.00 ± 0.02 1.99 ± 0.15＜0.05

2.4 miR-199b-5p 靶向APMAP 对NF-κB 信号通路的影响 见表8、9。

表8 各组TRAF3、NIK蛋白表达比较（±s）

表8 各组TRAF3、NIK蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与阿霉素+NC mimic 组比较，bP＜0.05；与阿霉素+NC inhibitor组比较，cP＜0.05。

组别对照组阿霉素组阿霉素+NC mimic组阿霉素+miR-199b-5p mimic组阿霉素+NC inhibitor组阿霉素+miR-199b-5p inhibitor组TRAF3蛋白1.00 ± 0.02 0.63 ± 0.12a 0.61 ± 0.12 0.34 ± 0.22b 0.55 ± 0.12 1.55 ± 0.22c NIK蛋白1.01 ± 0.02 1.87 ± 0.13a 1.90 ± 0.21 2.50 ± 0.21b 1.86 ± 0.16 0.65 ± 0.20c

3 讨论

有研究显示，在阿霉素处理的足细胞中miR-199b-5p 表达升高，沉默miR-199b-5p 表达通过靶向RGS10 抑制阿霉素诱导的足细胞凋亡［6］。本研究发现，miR-199b-5p 过表达可以促进足细胞凋亡，下调miR-199b-5p表达可缓解阿霉素诱导的足细胞凋亡。这与先前的报道一致。

miRNA作用机制之一是通过不完全互补结合至基因mRNA 3′UTR区，从而阻断mRNA的翻译过程［7］。因此，本研究拟通过寻找miR-199b-5p的下游靶基因，探讨miR-199b-5p在足细胞凋亡中的潜在作用机制。通过分析TargetScan、miRDB 数据库发现，APMAP 可能是miR-199b-5p的下游靶基因。APMAP是一类脂肪细胞质膜相关蛋白，在多种疾病进展中发挥重要作用［8-10］。但是，目前尚无研究表明APMAP在肾脏疾病足细胞凋亡中的作用。为了证实APMAP是否为miR-199b-5p的真正分子靶标，本研究使用双荧光素酶报告基因实验，结果显示，miR-199b-5p 可显著降低HEK-293T细胞中野生型APMAP的荧光素酶活性，但突变体APMAP未观察到该结果。表明在阿霉素干预的足细胞中APMAP表达明显降低，沉默miR-199b-5p后APMAP表达明显升高，说明miR-199b-5p可能通过负性调控APMAP参与足细胞凋亡。接下来为了证实APMAP对足细胞凋亡的影响，本研究对APMAP进行挽救实验。过表达APMAP可以逆转miR-199b-5p对足细胞凋亡的影响，沉默APMAP 可以加剧miR-199b-5p对足细胞凋亡的促进作用。表明miR-199b-5p可以通过负性靶向调控APMAP促进足细胞凋亡。

表9 各组TRAF3、NIK蛋白表达比较（±s）

表9 各组TRAF3、NIK蛋白表达比较（±s）

注：与阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-NC 组比较，aP＜0.05；与阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-NC RNAi组比较，bP＜0.05。

组别阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-NC组阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-APMAP组阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-NC RNAi组阿霉素+miR-199b-5p inhibitor +Ad-APMAP RNAi组TRAF3蛋白0.32 ± 0.01 1.36 ± 0.12a 1.56 ± 0.12 0.43 ± 0.02b NIK蛋白1.67 ± 0.14 0.60 ± 0.20a 0.52 ± 0.10 2.00 ± 0.02b

有研究报道，APMAP 参与了NF-κB 信号通路的调控，下调APMAP 表达可促进NF-κB 信号通路激活［11］。NF-κB信号通路参与调控多种生物功能，激活NF-κB 信号通路可降低TNF 诱导的细胞凋亡，而在NF-κB活性缺乏的情况下，TNF诱导的细胞凋亡的敏感性将显著增加［12］。研究表明，NF-κB信号通路在足细胞凋亡中起至关重要的作用。在糖尿病肾病小鼠模型和高糖干预下，足细胞中NF-κB 和下游TLR 信号通路被激活，促进各种炎症因子释放，从而促进足细胞凋亡［13］。研究显示，NF-κB信号转导通常有两种激活通路，一种为经典的NF-κB信号通路，炎症因子与相关受体结合，激活IkBa 激酶，使IkBa 磷酸化，NF-κB启动，信号转导被激活［14］。本研究利用另一种非经典的信号转导方式，通过检测TRAF3 和NIK 蛋白的表达探讨NF-κB 信号转导对足细胞凋亡的影响。发现在阿霉素的干预下，NF-κB通路激活。通过沉默miR-199b-5p和过表达APMAP发现NF-κB信号转导被抑制，由此说明miR-199b-5p 能够通过抑制APMAP表达激活TRAF3/NIK/NF-κB信号通路。

综上所述，miR-199b-5p可能与慢性肾脏病足细胞凋亡有关，可通过靶向调控APMAP 激活TRAF3/NIK/NF-κB 信号通路促进足细胞凋亡。miR-199b-5p有望成为慢性肾脏病治疗的新靶点。