基于数据挖掘探讨BOLA2在肺腺癌中的表达及临床意义①

肖丹丹 喻双雪 梁玉灵 罗 丹 王文军 （西南医科大学附属医院呼吸与危重症医学科，泸州 646000）

肺癌是全球最多的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因之一。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占80%以上，根据组织学主要分为两类：肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC），其中LUAD 为最常见的组织学亚型［1］。关于LUAD的新型治疗方式越来越多，疗效随之提高，但肺癌的五年生存率为4%～17%［2］。因此，有必要通过多数据库基因网络探索治疗LUAD 的新型靶点及寻找可以用于诊断及治疗的新型标志物。越来越多的研究发现，铁代谢紊乱与肺癌的发生、发展、免疫逃避和耐药性有关［3-5］。铁是人体必需的微量元素，参与多种生理和细胞过程。此外，多种形式的细胞死亡（包括凋亡、坏死、铁死亡等）也被证实与铁水平有关［4-5］。

BOLA2 是BOLA 蛋白家族成员之一，作为铁伴侣胞质蛋白参与细胞内铁调控途径及含铁/硫簇蛋白（Fe/S 簇）的成熟，维持铁稳态［6-7］。近年来，研究发现BOLA2 在肝癌、卵巢癌中表达失调，并与患者预后密切相关［8-9］。BOLA2可能参与癌症的发生、发展、转移过程。然而，BOLA2在LUAD中的表达模式和作用尚未阐明。本研究采用多种数据库初步分析BOLA2 在LUAD 中的表达及临床意义，并探讨 BOLA2 可能参与的通路及在免疫微环境中的作用，以期寻找新的治疗靶点和新型诊断及预后标志物。

1 材料与方法

1.1 BOLA2 mRNA 差异表达分析 Oncomine 数据库用于分析BOLA2 在多种癌症中的差异表达。本研究分析BOLA2 在LUAD 与相邻正常组织中的表达差异。筛选条件如下：①Gene：BOLA2；②Analysis type： cancervsnormal analysis；③Cancer type：lung cancer；④P＜0.05；Fold change：＞1.5；Gene ranking：top 10%；data type：mRNA。

1.2 探讨BOLA2 表达量与临床特征的关系 本研究通过UALCAN 分析BOLA2 在LUAD 中的表达量及其与临床特征（如年龄、淋巴结转移、TNM 分期、TP53 突变等）的关系。同时，探讨BOLA2 在LUAD中的蛋白表达和甲基化水平。

1.3 BOLA2 表达对LUAD 患者预后的影响 采用Kaplan-Meier 数据库分析BOLA2 与LUAD 总生存期（OS）、无进展生存期（FP）、进展后生存期（PPS）的关系。将BOLA2表达情况以中位数为临界值分为高、低表达两组。同时多因素Cox 回归分析再次认证评估危险比（HR）、95%可信区间（CI）和log-rankP值。

1.4 相关基因筛选及KEEG 通路分析 通过LinkedOmics 中的LinkFinder 模 块，在TCGA LUAD队列（LUAD，n=515）中，筛选与BOLA2 相关的正负表达基因，并进一步利用LinkInterpreter 模块分析KEEG 通路，选择参数包括富集分析：KEEG pathway；错误率 （FDR）＜0.05；模拟500次。

1.5 BOLA2 与免疫细胞浸润的关系 利用TISIDB数据库中的Lymphocyte 模块分析BOLA2 表达水平与各种免疫细胞浸润之间的关系，并展示与BOLA2表达显著相关的免疫细胞浸润情况。

2 结果

2.1 BOLA2 在LUAD 中的mRNA 表达 Oncomine数据库分析表明，共有314 个研究比较了BOLA2 在癌症组织与正常组织中的表达差异，其中有83项研究表明BOLA2 在肿瘤组织中过表达，仅在7 项研究中低表达。16 项研究中发现，与癌旁组织比较，肺癌组织中BOLA2 mRNA 均表达升高。进一步分析BOLA2 在LUAD 的表达情况表明，共有8 项研究分析LUAD 与癌旁组织的BOLA2 mRNA 表达，统计分析发现BOLA2 在LUAD 中呈高表达（P=0.002）。如图1、表1 所示，在多项研究中发现，LUAD 组织中BOLA2表达量升高，差异具有统计学意义。

图1 BOLA2 mRNA在不同癌症中的表达水平Fig.1 mRNA expression levels of BOLA2 in different types of cancers

表1 LUAD中BOLA2 mRNA的表达水平（Oncomine）Tab.1 mRNA expressions of BOLA2 in LUAD （Oncomine）

2.2 BOLA2 表达量与LUAD 患者临床特征之间的关系 利用UALCAN 数据库研究BOLA2 与515 例LUAD 患者年龄、吸烟状态、分期、淋巴结转移情况及TP53 突变之间的关系，结果显示，BOLA2 较正常对照组而言，在LUAD 中呈高表达，与Oncomine 结果一致（图2A、2B）。如图2C，在年龄亚组分析中发现，中青年（21～40岁、41～60岁）的LUAD患者BOLA2 mRNA 表达量高于老年患者（61～80 岁、81～100 岁），说明BOLA2 表达水平可能在中青年患者中更高（BOLA2 在年龄亚组中有232 例患者年龄资料未获得）。BOLA2 与患者吸烟状态之间也相关（图2D），吸烟的LUAD 患者中BOLA2 表达量高于未吸烟及既往吸烟的肺癌患者（BOLA2在吸烟亚组中有19例患者吸烟状态未获得）。对于淋巴结转移情况，N0、N1、N2 淋巴结转移患者的BOLA2 表达水平显著高于正常对照组，在N3 淋巴结转移的LUAD 患者中表达量最高（图2E），提示BOLA2 可能与较差的临床特征相关（BOLA2 在淋巴转移亚组中有1 例患者淋巴结转移资料未获得，另外11例患者无法评估有无淋巴结转移）。无论TP53 是否突变，在LUAD 中，BOLA2 表达升高（图2F），并在TP53 突变患者中表达更为显著（BOLA2在TP53 亚组其中有3 例患者样本没有完整的外显子组测序数据）。但在分期亚型中，各分期中BOLA2 表达量高于正常对照组，但各分期间差异无统计学意义。

图2 BOLA2表达与LUAD患者临床特征的相关性Fig.2 Relationship between BOLA2 expression and clinic characteristics in patient with LUAD

2.3 BOLA2蛋白表达及甲基化水平 通过UALCAN数据库进一步分析，与正常肺组织相比，BOLA2蛋白表达水平在LUAD 仍呈高表达，见图3A。与BOLA2 mRNA 过表达结果一致，说明过表达的BOLA2 可能成为LUAD 诊断的新型标志物。在LUAD 患者中，BOLA2 基因甲基化水平较正常肺组织中升高，差异具有统计学意义（P＜0.001，图3B），BOLA2 在LUAD中高表达可能是异常甲基化所致。

图3 BOLA2在LUAD患者中的蛋白表达和甲基化水平Fig.3 Protein expression and methylation level of BOLA2 in patients with LUAD

2.4 BOLA2表达量与LUAD患者生存期的关系 综合上述结果发现，LUAD 患者中，BOLA2 的mRNA和蛋白表达均高于正常对照组，进而研究BOLA2表达量与719 例LUAD 患者预后的关系，结果显示，高表达的BOLA2 可预测LUAD 患者较差的OS、FP 以及PPS（图4）。本研究利用多因素Cox 回归模型评估BOLA2 表达水平与LUAD 患者总预后的关系，纳入肿瘤分期、性别、吸烟状态等因素，发现过表达的BOLA2 是LUAD 患者预后的独立危险因素（P=0.000 5，HR=2.32，表2）。

图4 BOLA2与LUAD患者生存期的关系Fig.4 Relationship between BOLA2 and survival of patients with LUAD

表2 肺腺癌患者预后的多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of prognosis in patients with LUAD

2.5 相关基因筛选 如图5 所示，在TCGA_LUAD数据集中，与BOLA2 共表达的显著正相关基因共 6 004 个，负相关基因共7 153 个。据热图显示，PPP4C、POP7、ROMO1、MRPS12、MRPL12 与BOLA2呈显著正相关，KIAA1109 与BOLA2 呈显著负相关。对相关基因进行KEEG 通路分析，结果表明，相关基因主要富集于核糖体、蛋白酶体、嘌呤嘧啶代谢、剪接体、DNA 复制、真核生物中的核糖体生物发生、碳代谢、谷胱甘肽代谢等通路过程，表明BOLA2 可能通过影响代谢通路、生物合成等过程，促进LUAD 的发生、发展。

图5 LUAD患者中BOLA2的共表达基因Fig.5 Co-expressed genes of BOLA2 in patients with LUAD

2.6 在LUAD 中BOLA2 表达量与免疫细胞浸润的关系 多种癌症中发现铁代谢与肿瘤免疫微环境密切相关，进一步分析BOLA2表达与免疫细胞之间的关系，发现BOLA2表达与多种癌症微环境中的免疫浸润水平存在联系。LUAD 患者中，BOLA2 表达水平与多种免疫细胞相关。如图6 所示，BOLA2 表达与自然杀伤细胞（NK，RHO=-0.359，P=2.79e-17）、肥大细胞（Mast，RHO=-0.341，P=2.17e-15）、未成熟B 细胞（Imm_B，RHO=-0.289，P=2.72e-11）、效应 记 忆CD4T 细 胞（Tem_CD4，RHO=-0.263，P=1.4e-9）呈显著负相关。

图6 BOLA2表达与免疫细胞浸润的关系Fig.6 Relationship between BOLA2 expression and immune cell infiltration

3 讨论

在许多国家中LUAD 的发病率及病死率位于恶性肿瘤的前列，严重影响人类生活质量及生命［1］。然而，LUAD 的传统治疗方式、靶向治疗以及免疫治疗尚未达到理想的疗效，有必要探索新型的标志物及治疗靶点。越来越多的证据表明，多种癌症（包括肺癌）中存在铁代谢紊乱［3，10］。铁是合成铁硫簇（Fe/S 簇）的重要元素，而Fe/S 簇参与多种重要生物酶合成，这些酶在细胞呼吸、氧化代谢、核苷酸代谢、DNA 复制及修复等过程中起到重要的作用［11］。高浓度的铁和含Fe/S 簇的酶能显著促进肿瘤细胞生长［10］。铁水平与Wnt、Myc 以及缺氧诱导因子等致癌及促癌信号通路相关［12］。研究发现，在NSCLC细胞中，高浓度铁可通过干扰细胞氧化应激，诱导癌症干细胞亚群形成，促进癌细胞增殖及转移［13］。因此，癌细胞比正常细胞对铁的依赖性更强。

铁伴侣蛋白BOLA2 可与GLRX3 形成［2Fe-2S］桥接的异二聚体复合物，连接细胞中的亚铁和铁硫分配系统，是细胞内铁稳态的关键调节因子［5-6］。近年来，多项研究表明，BOLA2 表达与肺部疾病有关。在高空气污染地区，BOLA2 表达与儿童哮喘之间存在关联，并对比哮喘与非哮喘患者，气道上皮细胞中BOLA2 有显著差异性表达［14］。呼吸道合胞病毒感染人支气管和小气道上皮细胞后会上调BOLA2表达［15］。此外，BOLA2 在癌症中也发挥着重要作用。BOLA2 可通过干扰P62-Keap1-Nrf2 通路，参与肝癌细胞自噬和氧化应激过程，维持肝癌细胞增殖、侵袭［7］。BOLA2 也能促进肝癌致癌基因Myc 的表达［16］。高表达的BOLA2 可预测肝癌伴肿瘤出血患者的不良预后。在卵巢癌中，BOLA2 呈过表达，与癌症患者的较差临床特征及预后显著相关［7-8］。然而BOLA2 在NSCLC 中的作用机制及预后价值尚未阐明。

本研究通过生物信息学方法对BOLA2 在NSCLC 中的转录水平、预后价值和潜在作用进行全面研究。基于Oncomine 和UALCAN 数据库发现，BOLA2 在乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、前列腺癌等多种癌症中均呈过表达，两个数据库相互验证发现，LUAD患者中的BOLA2 表达量均高于正常对照组，并与LUAD 患者的临床特征相关。BOLA2 在吸烟、TP53突变、N3 淋巴结转移的LUAD 患者中表达升高。既往研究表明，上述因素已被证明是LUAD 不良预后的因素，说明BOLA2 可能为LUAD 的促癌基因［17-18］。从蛋白水平研究发现，111 例LUAD 患者的BOLA2蛋白表达水平高于正常对照组。另外，从基因甲基化水平发现，BOLA2 的甲基化水平较正常对照组明显升高。既往研究发现，异常甲基化表达发生于肿瘤早期，并随着肿瘤进展而增加［19］。一项研究也表明，BOLA2 基因高甲基化水平与哮喘患者对激素的反应性相关［14］。因此，BOLA2 甲基化修饰改变可能与LUAD 的起始、进展相关。生存分析显示，过表达的BOLA2 与LUAD 患者短的生存期显著相关。综上所述，在LUAD患者中，BOLA2在转录及蛋白表达水平均呈高表达，可能参与LUAD 的发生发展，是LUAD预后的一个不利因素。

进一步探究BOLA2 在LUAD 中潜在的作用机制，使用LinkedOmics 数据库分析得到与BOLA2 呈显著正相关的基因（如PPP4C、POP7、ROMO1、MRPS12、MRPL12 等），这些基因认为与癌症的发生、发展、转移及侵袭相关［20-22］。此外，利用相关基因进行KEEG 通路分析，结果发现BOLA2 相关基因参与的通路可能包括核糖体、真核生物中的核糖体生物发生、蛋白酶体、嘌呤嘧啶代谢等，这些通路均被报道参与了肿瘤的发生。如核糖体数量的增加和修饰的改变均驱动肿瘤发生。核糖体生物发生能维持肿瘤细胞生长和增殖［23］。蛋白酶参与受损蛋白质降解，调节细胞周期及转录蛋白，干扰凋亡、Wnt 通路等过程，在多种癌症中发挥作用［24］。在癌症进展过程中，铁代谢紊乱可干扰免疫应答，导致肿瘤细胞免疫逃逸。在LUAD 中，高表达BOLA2 与多种免疫淋巴细胞减少相关。既往研究表明，免疫微环境中免疫淋巴细胞减少与LUAD 患者不良预后相关［25］，说明过表达BOLA2 的LUAD 患者预后不良可能是免疫细胞被抑制所致。BOLA2 在免疫微环境中的作用如何，以及能否联合免疫治疗作为新型治疗靶点需要进一步研究。

本研究发现，过表达BOLA2 可能介导LUAD 的发生和进展，影响免疫细胞浸润水平，并与不良预后相关，可能是新的预后指标和潜在的治疗靶点。这些发现利于理解BOLA2 在LUAD 中的作用，但对其致癌机制的分析和新型药物研究需进一步探讨。