LINC01980 在宫颈癌中的表达及调控LIN28B 表达促进宫颈癌生长的作用机制①

王春梅 吴德慧 康 燕 魏顺英 马登云 （青海红十字医院妇一科，西宁 810000）

宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤之一，发病率和病死率较高，且逐渐年轻化，严重威胁女性健康［1］。随着医学技术发展，早期宫颈癌可通过手术、放化疗治疗，但晚期或复发转移患者预后较差［2］。随着分子生物学发展，靶向治疗为癌症临床治疗提供了新思路，分析宫颈癌发展的相关机制可能为其临床治疗提供新方法［3］。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度超过200 nt 的不具备蛋白编码功能的RNA 分子，可与DNA、RNA 和蛋白相互作用，在表观遗传、转录和翻译水平调节基因表达和蛋白活性，参与染色质修饰、转录激活和抑制等生物学过程［4］。lncRNA 不仅参与机体正常生理活动，在疾病发生发展尤其是肿瘤发生过程中具有重要作用，寻找宫颈癌中特异表达的lncRNA，并分析其在宫颈癌中的分子机制，可能有助于寻找宫颈癌治疗靶点，为宫颈癌靶向治疗提供新思路［5］。课题组前期生物信息学分析发现，宫颈癌中LINC01980表达显著上调，与肝癌、食管癌发生发展及预后相关，但其在宫颈癌中的表达及其对宫颈癌的影响尚未阐明［6-8］。LIN28B 是一种保守RNA 结合蛋白，与宫颈癌、卵巢癌等女性生殖系统恶性肿瘤发生有关，可能是治疗女性生殖系统恶性肿瘤的潜在靶标［9-10］。本研究生物信息学预测结果表明，LIN28B 与LINC01980 具有相互作用位点，因此，本研究拟探讨LINC01980在宫颈癌中的表达及其对宫颈癌细胞生长影响的可能机制，为宫颈癌治疗提供新的靶标。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 选取2020 年1 月至2021 年5 月青海红十字医院收治的病理学诊断为宫颈癌的患者60 例作为宫颈癌组，年龄35～67 岁，平均年龄（48.78±8.83）岁。排除标准：①接受手术、放化疗等治疗；②合并其他妇科疾病者；③合并肝、肾等重大功能脏器不全者；④合并其他恶性肿瘤患者。选取同期青海红十字医院健康体检者（宫颈未发生病变）60 例作为健康组，年龄33～70 岁，平均年龄（47.95±10.89）岁。两组研究对象年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。研究经青海红十字医院伦理委员会审核批准。

1.1.2 试剂与仪器 人宫颈癌细胞系Hela（TCHu187）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；MEM培养基（41500034）、胎牛血清（10099）、胰蛋白酶（25200056）购自美国Gibco 公司；Lipofectamine3000试剂盒（L3000015）购自美国Invitrogen公司；RNAiso plus（9108Q）购自日本TaKaRa 公司；反转录试剂盒（205311）、qRT-PCR 试剂盒（204443）购自德国QIAGEN 公司；CCK-8（C0037）、蛋白提取试剂盒（P0012）、BCA 蛋白定量试剂盒（C1062）购自上海碧云天生物技术公司；DNA 含量检测试剂盒（细胞周期，CA1510）、AnnexinV Alexa Fluor488/PI凋亡检测试剂盒（CA1040）购自北京索莱宝科技有限公司；protein A/G 磁珠（sc-2003）购自美国Santa Cruz Technology公司；Magna RIP Kit（17-701）购自美国Merck Millipore；PierceTM生物素 3'末端DNA 标记试剂盒（89818）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；兔抗人细胞周期蛋白D1（CyclinD1，ab16663）、周期蛋白依赖性激酶4（Cyclin-dependent kinases 4，CDK4，ab108357）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3，ab32351）、β-actin（ab8227）、山羊抗兔IgG H&L（ab6721）购自英国Abcam公司；LINC01980、LIN28B、GAPDH 引物和siRNA 质粒、siNC 质粒、pcDNA3.1载体、pcDNA3.1-LINC28B 质粒由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；NanoDrop one 超微量分光光度计、Multiskan FC 酶标仪购自美国Thermo Fisher公司；CFX96 Touch 实时荧光定量PCR 仪、Gel-Doc XR蛋白凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 生物信息学工具iBio Tools V5.0（http://www.chrisapp.xyz：3838/R/AnnoE2/，设置参数：P＜0.05，logFC=1）预测宫颈癌差异表达基因，catRAPID（http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group）预测lncRNA 与蛋白的相互结合关系，生物信息学预测LINC01980与LIN28B相互作用关系，提示辨识度（Discriminative Power）＞20%可能发生交互作用，＞75%极有可能存在交互作用。

1.2.2 血液采集 宫颈癌患者于术前、对照组于体检当日抽取肘部静脉血3 ml，4 ℃、3 000 r/min 离心15 min，转移上清至新离心管，-80 ℃保存。

1.2.3 细胞培养与分组 常规复苏宫颈癌细胞系Hela，加至含10%胎牛血清的MEM 培养基，37 ℃、5%CO2培养，2～3 d 更换1 次培养液，细胞融合度达到80%左右时胰蛋白酶消化传代。收集细胞，调整细胞数为6×105个/孔，接种至6 孔板，细胞融合度达到80%时更换为无血清DMEM 培养基，按照Lipofectamine3000 试 剂 盒 说 明 书 将 Lnc-NC、si-LINC01980、si-LINC01980+LIN28B-NC、si-LINC01980+LIN28B 分别转染至Hela 细胞，分为Lnc-NC 组、si-LINC01980 组、si-LINC01980+LIN28B-NC 组 和si-LINC01980+LIN28B 组，对照组仅添加新鲜培养液，转染48 h后收集细胞进行后续实验。

1.2.4 qRT-PCR 检测血清及细胞中LINC01980、LIN28B mRNA 表达 RNAiso Plus 试剂盒提取血清及Hela细胞中总RNA并检测浓度，反转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA，进行qRT-PCR 反应，反应条件：预变性95 ℃ 45 s，变性95 ℃ 30 s，退火60/58/62 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt计算血清及Hela 细胞中LINC01980、LIN28B mRNA相对表达。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.5 RNA 免疫共沉淀 收集Hela 细胞，离心，加入等体积RIP裂解缓冲液吹打悬浮，取5 g 蛋白抗体于免疫沉淀缓冲液内与protein A/G 磁珠结合2 h，加入100 µl 细胞裂解物，4 ℃轻柔搅动孵育1 h，离心，弃上清，加入400 µl洗脱缓冲液4 ℃孵育2 h，TRIzol提取RNA，qRT-PCR 检测 LINC01980表达。

1.2.6 RNA pull-down 根据RNA pull-down 试剂盒说明书实验，将生物素标记的LINC01980 转染至Hela 细胞，培养48 h，收集细胞，加入细胞裂解液和链霉亲和素琼脂糖珠4 ℃孵育 3 h，预冷裂解缓冲液洗涤3 次，十二烷基硫酸钠缓冲液中回收蛋白，Western blot检测LIN28B表达。

1.2.7 CCK-8 检测细胞活力 收集1.2.3 中转染后的各组Hela 细胞，每组设置3 个重复，每个重复 3 个复孔，弃原培养基，37 ℃、5%CO2培养48 h，每孔加入10 µl CCK-8 试剂和100 µl 新鲜培养基，37 ℃避光培养2 h，弃上清，酶标仪检测450 nm 处吸光度（OD）值，细胞活力（%）=实验孔OD 值/对照孔OD值×100%。

1.2.8 流式细胞术检测HTR-8/Svneo 细胞周期及凋亡 收集1.2.3 中转染48 h 的各组Hela 细胞，每组设置3 个重复，每个重复3 个复孔，PBS 洗涤， 1 500 r/min 离心5 min，收集细胞并调整浓度为 1×106个/ml，吸取1 ml 细胞悬液，离心，弃上清，70%预冷乙醇固定2 h，PBS 洗涤，离心，加100 µl RNase A 溶液，重悬细胞，37 ℃水浴30 min，加入400 µl PI染色液混匀，4 ℃遮光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期。收集1.2.3 中转染48 h 的各组Hela 细胞，每组设置3 个重复，每个重复3 个复孔，调整细胞浓度为1×106个/ml，PBS 洗涤，Binding Buffer 重悬细胞，吸取100 µl细胞悬液加至流式管，再加入5 µl室温遮光孵育10 min，加入5 µl PI 染色液室温遮光孵育5 min，加入PBS 至500 µl，混匀，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.9 Western blot 检测细胞蛋白表达 收集1.2.3 中培养48 h 的各组细胞，调整细胞数为 5×104个/孔，加至24孔板，弃上清，PBS洗涤，每组设置3 个重复，每个重复3 个复孔，试剂盒提取细胞总蛋白并检测蛋白浓度，SDS-PAGE 凝胶电泳，封闭，分别加入兔抗人CyclinD1、CDK4、caspase-3、β-actin 稀释液4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜，加入山羊抗兔IgG H&L 二抗稀释液（1∶2 000 稀释），室温孵育1 h，TBST 洗膜，蛋白凝胶成像仪成像，Image J 分析蛋白相对表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS25.0软件进行数据分析，计量资料采用±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌组与健康组血清LINC01980、LIN28B mRNA 表达比较 生物信息学工具iBio Tools V5.0（http://www.chrisapp.xyz：3838/R/AnnoE2/）预测结果表明，LINC01980在宫颈癌组织中表达上调（图1A）。与健康组比较，宫颈癌组血清LINC01980、LIN28B mRNA表达显著升高（P＜0.001，图1B）。

图1 两组血清LINC01980、LIN28B mRNA表达Fig.1 Expressions of serum LINC01980 and LIN28B mRNA in two groups

2.2 生物信息学网站预测LINC01980 结合蛋白 生物信息学网站（http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group）预测结果表明：LINC01980 RNA 与LIN28B 存在结合位点，且在1841-1990 处辨识度达88%，极有可能发生相互作用（表2）。

表2 生物信息学网站预测LINC01980结合蛋白Tab.2 Binding proteins of LINC01980 predicted by bioinformatics website

2.3 RNA 免 疫 共 沉 淀、RNA pull-down 检 测LINC01980 与LIN28B 结合 RNA 免疫共沉淀实验结果显示，与IgG 相比，免疫沉淀复合物中LINC01980 含量显著升高（P＜0.001，图2A），RNA pull-down 实验结果显示，LINC01980 正义链下拉的沉淀物中检测出LIN28B 表达（图2B）。提示LINC01980与LIN28B发生相互作用。

图2 LINC01980、LIN28B结合验证图Fig.2 LINC01980 and LIN28B combination verification diagram

2.4 沉 默LINC01980 对Hela 细 胞LINC01980、LIN28B mRNA 表达的影响 与对照组比较，Lnc-NC组LINC01980、LIN28B mRNA 表达差异无统计学意义（P＞0.05），si-LINC01980 组 LINC01980、LIN28B mRNA表达显著降低（P＜0.05，图3）。

图3 Hela细胞LINC01980、LIN28B mRNA表达Fig.3 LINC01980 and LIN28B mRNA expressions in Hela cells

2.5 沉默LINC01980 对Hela 细胞生长的影响 与对照组比较，Lnc-NC 组细胞活力、细胞凋亡率、细胞周期G0/G1期、S 期、G2/M 期细胞百分比、CyclinD1、CDK4、caspase-3 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），si-LINC01980 组细胞活力、S 期、G2/M 期细胞百分比、CyclinD1、CDK4、LIN28B 蛋白表达显著降低，细胞凋亡率、G0/G1期细胞百分比、caspase-3 蛋白表达显著升高（P＜0.001，图4）。

图4 沉默LINC01980表达对Hela细胞生长的影响Fig.4 Effect of silencing LINC01980 expression on Hela cell growth

2.6 过表达LIN28B逆转了沉默LINC01980对宫颈癌细胞生长的抑制作用 与si-LINC01980 组比较，si-LINC01980+LIN28B NC 组Hela 细胞活力、细胞凋亡率、G0/G1期、S 期、G2/M 期细胞百分比、CyclinD1、CDK4、caspase-3 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），si-LINC01980+LIN28B 组细胞活力、S 期、G2/M 期细胞百分比、CyclinD1、CDK4、LIN28B蛋白表达显著升高，细胞凋亡率、G0/G1期细胞百分比、caspase-3蛋白表达显著降低（P＜0.001，图5）。

图5 过表达LIN28B逆转了沉默LINC01980对宫颈癌细胞生长的抑制作用Fig.5 Overexpression of LIN28B reversed inhibitory effect of silencing LINC01980 on growth of cervical cancer cells

3 讨论

宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤，同时也是女性第四大常见恶性肿瘤，其发生主要与高危型人乳头状瘤病毒（human papillomaviruses，HPV）持续感染有关［11］。手术和放化疗等虽然有效降低了宫颈癌病死率，但晚期宫颈癌患者预后较差，宫颈癌仍是导致癌症死亡的主要原因之一［12］。lncRNA是由200～300 个核苷酸组成的非编码RNA，其异常表达与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和上皮-间质转化有关，部分lncRNA 可作为恶性肿瘤诊断和预后的潜在靶标和生物标志物［13-14］。LINC01980 是 一种新发现的癌症相关lncRNA，研究表明肝癌组织中LINC01980 表达显著高于癌旁组织，LINC01980高表达的肝癌患者预后较差，且敲除LINC01980 能够抑制肝癌细胞Huh7 和Hep3B 增殖，促进细胞凋亡［6］。微列阵分析表明，LINC01980 在食管鳞状细胞癌组织中显著上调，且与癌症TNM 分期、组织浸润和患者预后有关，体内外实验均表明LINC01980能够促进食管鳞状细胞癌生长［8］。本研究生物信息学分析结果表明，LINC01980在宫颈癌中表达上调，临床试验显示宫颈癌患者血清中LINC01980表达显著高于健康对照组，提示在宫颈癌中LINC01980 表达异常。体外实验结果显示，沉默LINC01980 可抑制宫颈癌细胞Hela 活力，提高G0/G1期细胞百分比，促进细胞凋亡。CyclinD1是调节细胞周期的主要蛋白之一，与CDK4 形成复合物调控G1期细胞向S 期过 渡［15］。本 研 究Western blot 结 果 表 明，沉 默LINC01980 能够抑制蛋白CyclinD1 和CDK4 表达，提示LINC01980可能通过调控细胞周期和凋亡参与宫颈癌Hela 细胞生长和增殖，具体机制有待进一步分析。

lncRNA 通过碱基互补和二级结构形成颈环，能够与DNA、RNA 和蛋白相互作用，在表观遗传、转录和转录后水平影响基因表达，进而参与染色质修饰、转录激活和抑制、核内运输等过程［16-17］。lncRNA牛磺酸上调基因1（taurine-upregulated gene 1，TUG1）通过靶向极光激酶A（aurora kinase A，AURKA）促进上皮性卵巢癌细胞SK-OV-3增殖和侵袭［18］。生物信息学数据库分析表明，LINC01980 与LIN28B 存在相互作用。LIN28B 是一种高度保守的RNA 结合蛋白，在胚胎干细胞和发育组织中高表达，参与细胞发育、代谢重编程、肿瘤发生等多种生物学过程［19］。LIN28B 可通过直接结合mRNA 或阻断miRNA 生物合成调节基因表达［20］。Let-7是一种肿瘤抑制因子，研究表明LIN28B 能够通过与let-7 前体末端相结合阻断Let-7 生物合成［21］。本研究表明，在Hela 细胞中沉默LINC01980 表达，LIN28B 表达降低，过表达LIN28B 可逆转沉默LINC01980 对宫颈癌细胞生长的抑制作用，提示LINC01980 协同LIN28B 在Hela细胞增殖、凋亡中发挥作用。本研究证实LIN28B是LINC01980 的结合蛋白且存在相互作用，提示LINC01980 可结合LIN28B，抑制Hela 细胞增殖，促进细胞凋亡，但LINC01980与LIN28B蛋白的结合序列及具体作用机制尚不明确，是后续研究重点。

综上，LINC01980 在宫颈癌中过表达，沉默LINC01980 能够抑制宫颈癌Hela 细胞生长，可能与LINC01980 调控LIN28B 有关。但本研究仅通过生物学分析及体外细胞实验探讨了LINC01980可能通过调控LIN28B 影响宫颈癌Hela 细胞生长，需在体内进一步验证，且LINC01980 是否通过其他途径影响宫颈癌Hela细胞生长有待后续研究。