circAGFG1在皮肤鳞状细胞癌组织中的表达及其对SCC13细胞增殖、迁移的影响

宋丹丹 宋明旭 孙 鸿 （江南大学附属医院皮肤科，无锡 214122）

皮肤鳞状细胞癌是我国常见的恶性肿瘤，目前其发病机制尚未阐明，随着医疗技术的进步，分子靶向治疗成为皮肤鳞状细胞癌的重点研究［1-2］。环状RNA（circular RNA，circRNA）不具有5'端帽子结构与3'端多聚腺苷酸尾巴结构，具有稳定性与组织特异性，circRNA 可充当微小RNA（miRNA）的海绵分子而调节其靶基因表达，研究表明circRNA 在皮肤鳞状细胞癌发生及发展过程中发挥重要调控作用［3-4］。circAGFG1 在三阴性乳腺癌中表达上调，可通过充当miR-195-5p 的海绵分子而抑制三阴性乳腺癌细胞增殖及转移下调其表达［5］。Starbase 预测显示circAGFG1与miR-653-5p存在结合位点。研究表明miR-653-5p 在黑色素瘤中呈低表达，上调其表达可抑制黑色素瘤增殖及转移［6］。但circAGFG1/miR-653-5p 分子轴在皮肤鳞状细胞癌发生及发展过程中的作用机制尚未明确。因此，本研究主要探讨circAGFG1是否可通过靶向调控miR-653-5p表达而调节皮肤鳞状细胞癌细胞增殖及迁移。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 临床资料 收集2018 年3 月至2020 年5 月江南大学附属医院收治的46 例皮肤鳞状细胞癌患者的癌组织及其相应癌旁组织标本，置于-80 ℃超低温冰箱内保存。其中男26 例，女20 例，年龄44～63 岁，平均年龄（52.35±3.26）岁，所有患者均经手术组织病理证实为皮肤鳞状细胞癌。本研究经江南大学附属医院伦理委员会批准，所有患者知情且签署同意书。

1.1.2 细胞与试剂 人皮肤鳞状细胞癌细胞SCC13 购自美国ATCC；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent 购自美国Invitrogen；DMEM 培养基、胎牛血清、Trizol 试剂购自上海碧云天生物；反转录试剂与SYBR 荧光定量试剂购自北京天根生化；si-NC、si-circAGFG1、miR-NC、miR-653-5p mimics、antimiR-NC、anti-miR-653-5p 购自广州锐博生物；野生型载体WT-circAGFG1、突变型载体MUT-circAGFG1 与双荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 将SCC13 细胞接种于6 孔板 （1×105个/孔），待细胞生长融合度约为70%时进行转染，细胞分为si-NC 组（转染50 nmol/L circAGFG小干扰RNA 的阴性对照）、si-circAGFG1 组（转染 50 nmol/L circAGFG 小干扰RNA）、miR-NC 组（转染50 nmol/L miR-653-5p 寡核苷酸模拟物的阴性对照mimic NC 序列）、miR-653-5p 组（转染50 nmol/L miR-653-5p 寡核苷酸模拟物）、si-circAGFG1+antimiR-NC 组（共转染50 nmol/L si-circAGFG1 与miR-653-5p特异性寡核苷酸抑制剂的阴性对照）、si-circ-AGFG1+anti-miR-653-5p组（共转染50 nmol/L si-circ-AGFG1与miR-653-5p特异性寡核苷酸抑制剂）。

1.2.2 qRT-PCR 检测circAGFG1、miR-653-5p 的表达水平 皮肤鳞状细胞癌组织、癌旁组织与各组SCC13 细胞加入1 ml Trizol 试剂提取总RNA，反转录合成cDNA，qRT-PCR 扩增反应体系：SYBR Green Master Mix 10 µl、正反向引物0.8 µl、cDNA 1 µl，ddH2O 补足体系至20 µl；反应条件：95 ℃预变性 5 min 循环1 次，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循环40 次。circAGFG1 以GAPDH 为内参，miR-653-5p 以U6 为内参，采用2-ΔΔCt法计算circ-AGFG1、miR-653-5p相对表达量。

1.2.3 CCK-8 实验检测细胞增殖 收集各组SCC13 细胞接种于96 孔板（3×103个/孔），每孔加入10 µl CCK-8 溶液，于培养箱内培养2 h，采用酶标仪检测450 nm波长处的光密度值（OD值）。

1.2.4 平板克隆形成实验 取各组SCC13 细胞 （1 000个/孔），于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱培养14 d，弃培养基，预冷PBS 洗涤，加入500 µl 甲醇固定细胞20 min，400 µl 1%结晶紫染色液染色15 min，对≥30 个细胞的集落进行观察，于显微镜下观察细胞克隆形成数。

1.2.5 划痕实验 收集各组SCC13 细胞接种于 6孔板（1×104个/孔），待细胞生长融合度达到80%时，用200 µl移液枪的枪头在细胞单层划线，于培养箱内培养24 h 后于显微镜下观察迁移距离，应用Image J软件检测各组细胞迁移距离并计算细胞划痕愈合率，愈合率（%）=（0 h 划痕宽度-24 h 划痕宽度）/0 h 划痕宽度×100%。

1.2.6 Transwell 实验检测细胞迁移 收集各组SCC13 细胞加入0.25%胰蛋白酶消化，加入不含血清的DMEM 培养液制备单细胞悬液（5×104个/ml），取200 µl 细胞悬液接种于上室，下室加入600 µl 含有10%胎牛血清的培养液，培养箱内培养24 h，多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染液染色10 min，显微镜下随机选取5个视野观察迁移细胞数。

1.2.7 双荧光素酶报告实验检测circAGFG1 与miR-653-5p 的靶向关系 Starbase 预测显示circAGFG1 与miR-653-5p 存在结合位点，构建荧光素酶报告基因载体：野生型载体WT-circAGFG1、突变型载体MUT-circAGFG1，分别将荧光素酶报告基因载体与miR-NC 或miR-653-5p mimics 共转染至SCC13 细胞，于培养箱内培养24 h，采用双荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。

1.3 统计学分析 采用统计学软件SPSS21.0进行分析，计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；Pearson法进行相关性分析，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 皮肤鳞状细胞癌组织中circAGFG1 和miR-653-5p 的表达 与癌旁组织比较，皮肤鳞状细胞癌组织中circAGFG1 的表达量升高（P＜0.05），miR-653-5p 的表达量降低（P＜0.05），见图1A、1B。采用Pearson 法分析皮肤鳞状细胞癌组织中circAGFG1与miR-653-5p 表达量的相关性，结果显示，circAGFG1与miR-653-5p呈负相关（r=-0.571 7，P＜0.001），见图1C。

图1 circAGFG1 和miR-653-5p 在皮肤鳞状细胞癌组织中表达的检测及相关性分析Fig.1 Detection and correlation analysis of circAGFG1 and miR-653-5p expressions in skin squamous cell carcinoma

2.2 下调circAGFG1 对SCC13 细胞增殖、迁移的影响 与si-NC 组比较，si-circAGFG1 组miR-653-5p 的表达量升高（P＜0.05），细胞增殖抑制率升高（P＜0.05），划痕愈合率降低（P＜0.05），细胞克隆形成数和迁移细胞数减少（P＜0.05），见表1。

表1 下调circAGFG1抑制SCC13细胞增殖、迁移（xˉ±s，n=9）Tab.1 Down-regulation of circAGFG1 inhibits proliferation and migration of SCC13 cells （xˉ±s，n=9）

2.3 circAGFG1 靶 向miR-653-5p circAGFG1 与miR-653-5p 存在结合位点，见图2。共转染野生型载体WT-circAGFG1 的细胞实验中，与miR-NC 组比较，miR-653-5p 组细胞荧光素酶活性降低（P＜0.05），见表2。表明circAGFG1 与miR-653-5p 存在靶向调控作用。

图2 circAGFG1与miR-653-5p存在结合位点Fig.2 There are binding sites for circAGFG1 and miR-653-5p

表2 双荧光素酶报告实验（xˉ±s，n=9）Tab.2 Double luciferase report experiment （xˉ±s，n=9）

2.4 miR-653-5p对SCC13细胞增殖、迁移的影响 与miR-NC 组比较，miR-653-5p 组细胞增殖抑制率升高（P＜0.05），划痕愈合率降低（P＜0.05），细胞克隆形成数和迁移细胞数减少（P＜0.05），见表3。

表3 miR-653-5p抑制SCC13细胞增殖、迁移（xˉ±s，n=9）Tab.3 miR-653-5p inhibits proliferation and migration of SCC13 cells （xˉ±s，n=9）

2.5 抑制miR-653-5p 对下调circAGFG1 处理的SCC13 细胞增殖、迁移的影响 与si-circAGFG1+ anti-miR-NC 组比较，si-circAGFG1+anti-miR-653-5p组细胞增殖抑制率降低（P＜0.05），划痕愈合率升高（P＜0.05），细胞克隆形成数和迁移细胞数增多（P＜0.05），见表4。

表4 抑制miR-653-5p可逆转下调circAGFG1对SCC13细胞增殖、迁移的抑制作用（xˉ±s，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-653-5p can reverse inhibitory effect of down-regulation of circAGFG1 on proliferation and migration of SCC13 cells （xˉ±s，n=9）

3 讨论

circRNA 可通过充当miRNA 的海绵分子而间接调控靶基因表达，研究表明circRNA 在皮肤鳞状细胞癌中表达异常，并可调节细胞生物学行为［7-9］。circRNA 可通过调节miRNA/mRNA 分子轴从而影响皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡等生物学过程，还可能作为皮肤鳞状细胞癌靶向治疗的潜在靶点［10-11］。

circAGFG1 可通过调节YY1/CTNNB1 分子轴促进结直肠癌细胞增殖及转移［12］。circAGFG1 可充当miR-28-5p的海绵分子调节HIF-1α 的表达而促进非小细胞肺癌进展［13］。circAGFG1 可通过下调p53 表达而促进宫颈癌细胞增殖及转移［14］。但circAGFG1在皮肤鳞状细胞癌中表达及其可能作用机制尚未明确。本研究结果显示，皮肤鳞状细胞癌组织中circAGFG1 的表达量升高，下调circAGFG1 表达后皮肤鳞状细胞癌细胞增殖抑制率升高，划痕愈合率降低，细胞克隆形成数和迁移细胞数减少，提示下调circAGFG1 表达可抑制皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、克隆形成及迁移。

miR-653-5p 在胃癌中表达下调，上调其表达可抑制胃癌细胞转移［15］。miR-653-5p 表达上调可抑制宫颈癌细胞增殖［16］。miR-653-5p 通过靶向调控MAPK6 而抑制乳腺癌细胞生长及迁移［17］。miR-653-5p 表达上调可抑制非小细胞肺癌细胞生长和侵袭［18］。本研究结果显示，皮肤鳞状细胞癌组织中miR-653-5p 的表达量降低，circAGFG1 与miR-653-5p 呈负相关，circAGFG1 可充当miR-653-5p 的海绵分子，并可负向调控miR-653-5p的表达，miR-653-5p过表达可抑制皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、克隆形成及迁移，而抑制miR-653-5p表达可拮抗下调circAGFG1 表达对皮肤鳞状细胞癌增殖、克隆形成及迁移的抑制作用。提示circAGFG1可通过靶向调控miR-653-5p 表达而促进皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、克隆形成及迁移。

综上所述，皮肤鳞状细胞癌组织中circAGFG1表达水平升高，miR-653-5p 的表达水平降低，circ-AGFG1 可靶向结合miR-653-5p，下调circAGFG1 表达可通过促进miR-653-5p 表达而抑制皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、克隆形成及迁移，circAGFG1 可能作为皮肤鳞状细胞癌治疗的潜在靶点。但关于其具体作用机制尚需进一步探究。