不同调控措施对草莓连作大棚土壤微生物群落的影响

李荣飞，杨仕品，王爱华，马红叶，王天鸿，韦 茜，钟霈霖，乔 荣

(1.贵州省农业科学院园艺研究所/贵州省园艺工程技术研究中心，贵州贵阳 550006；2.遵义市农业科学研究院，贵州遵义 563000)

近年来，设施草莓栽培面积逐年增加，草莓连作障碍发生越来越严重。现草莓连作障碍不仅在我国普遍存在，在全世界栽培草莓地区同样广泛存在。草莓连作障碍已成为草莓种植者及研究者广泛关注的焦点，是急需解决的问题。根据前人的研究，产生连作障碍的原因主要为土壤养分缺少或失衡[1]，土壤盐渍化严重[2-3]，植物自毒物质的分泌[4-5]，土壤微生物变化[6]等。目前，土壤微生物被认为是连作障碍的主要影响因子[7]。土壤微生物是反映土壤肥力和生产力的一个重要指标。一般情况，具有较高的细菌和放线菌数量的土壤较肥沃，而真菌数量居多的土壤较贫瘠[8]。连作后土壤微生物变化在黄瓜[9]、韭菜[10]、苹果[11]等果蔬中均有研究。众多研究者认为，长期连作会改变根际土壤的微生物群落结构，导致细菌数量下降，真菌数量增多。草莓连作会使土壤微生物群落结构失衡，影响植株生长[12]。因此，研究者建议生产上应尽可能采取措施避免连作，并及时对连作土壤进行修复改良。

针对大棚草莓连作障碍，现在生产中常用的修复方法有合理轮作、土壤消毒、生防菌利用、生物炭利用等。合理轮作，不同作物间轮作、扩大草莓种植之间的间距是克服连作障碍最常见的一种防范措施[13-14]，进行大棚草莓—鲜食玉米轮作，经济效益显著提高[15]。土壤消毒，使用化学药剂消毒或者高温(太阳能)消毒，使用化学药剂进行土壤消毒是目前防治草莓连作病害的主要手段。生防菌利用，利用降解毒素微生物，如细菌菌株 B3512对羟基苯甲酸有降解作用[16]。生物炭利用，生物炭具有作为污染土壤的一种化学钝化修复剂的物理化学性质，通过吸附、沉淀、离子交换、络合等系列反应，使污染物向稳定化形态转化，以降低污染物的可迁移性和生物可利用性，达到污染土壤原位修复的目的[17]。且生物炭可增加土壤微生物的基础呼吸作用和生物量[18]，从而增强了微生物对有机污染物的降解能力[19]，这可能有利于缓解连作障碍问题。修复方法较多，但各有其优点和不足，少有研究者对多种方法进行比较、筛选。因此，本研究采用轮作、棉隆消毒、生物炭利用、休耕、淋雨等不同调控措施，通过高通量测序技术测定根际土壤细菌、真菌群落多样性和组成，比较不同调控措施效果，以期为草莓连作障碍调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验在贵州省园艺研究所草莓展示园大棚中进行，试验种植草莓品种为黔莓1号，于2019年8月下旬移栽。试验设置了9个处理和2个对照，分别为处理1(T1)甜玉米轮作(4月下旬至8月上旬种植甜玉米)；处理2(T2)棉隆闷棚(用量为 35 g/m2，参照王广印等的方法[20])；处理3(T3)小麦秸秆炭；处理4(T4)稻壳炭；处理5(T5)竹炭；处理6(T6)木质炭；处理7(T7)菌渣混土(用量 0.9 kg/m2，参照聂胜委等的方法[21])；处理8(T8)未揭棚膜休耕1年；处理9(T9)揭棚膜淋雨1年；对照1(CK1)未处理，对照2(CK2)新土花盆种植。CK2为连作大棚周边未种植过草莓的土壤，前茬种植葡萄。T3～T6处理为生物炭处理，用量为 10 kg/m2(参照房彬等的方法[22])，T3～T5处理生物炭来源于南京勤丰秸秆科技有限公司。T1～T9处理和CK1，采用随机区组处理，每个处理3次重复(小区)，每个小区 20 m。CK2设置3次重复，每次重复20盆，随机排列。T1～T7处理、CK1、CK2于同一个大棚中，T8、T9处理于相邻大棚，2个大棚中管理同步。各处理定植前土壤理化性状见表1。

表1 不同处理定植前土壤理化性状

1.2 样品采集

于2020年4月中旬取根际土测微生物群落多样性。土壤样本采集按“S”形分别布点，去除表土，采集10～20 cm土层的根系，轻轻抖动根际土壤，每个处理采5个点。同一处理的土壤混合均匀，按四分法处理，将约2 kg的土壤样品尽快带回实验室。将采集的土样去掉石块、植物根系、落叶等杂物，用灭菌的 50 mL 离心管装好，随即用干冰保存寄到上海美吉生物医药科技有限公司测定土壤微生物多样性。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA 抽提和PCR扩增 根据 E.Z.N.A.® soil DNA kit(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)说明书进行微生物群落总DNA 抽提，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，用NanoDrop 2000测定DNA 浓度和纯度。使用引物ITS-1F/ITS-2R对真菌rRNA基因ITS可变区进行 PCR 扩增和引物16S-338F/16S-806R对16S rRNA基因V3～V4 可变区进行 PCR 扩增。每个样本3次重复。

1.3.2 Illumina Miseq 测序 将同一样本的PCR产物混合后，使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)进行回收产物纯化，用2%琼脂糖凝胶电泳检测，QuantusTMFluorometer(Promega，USA)对回收产物进行检测定量。使用NEXTFLEX® Rapid DNA-Seq Kit进行建库。利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。

1.4 数据处理

数据分析采用上海美吉生信云分析。使用fastp(https：//github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0)软件对原始测序序列进行质控[23]，使用FLASH(http：//www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7)软件进行拼接[24]。利用RDP classifier(http：//rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)对每条序列进行物种分类注释[25]，比对真菌ITS数据库和16S rRNA数据库。

2 结果与分析

2.1 不同处理土壤真菌、细菌群落多样性

2.1.1 真菌群落多样性 土壤真菌群落通过高通量测序分析，从11个样品中获得了857 065个有效序列，并从序列中鉴定出676个操作分类单元(OTU)，被鉴定为 11个门209个属。从表2可以看出，T1、T2、T4、T8、T9处理群落丰富度高于CK1，且T4处理群落多样性、均一性、谱系多样性均高于CK1，但低于CK2。真菌群落丰富度指数Sobs、Chao、ACE均为T1处理最高，其次是T9处理、CK2，其后依次是T2、T4、T8处理>CK1、T3、T5>T7>T6处理。群落多样性指数Shannon以CK2最高，其次是T4处理，T8处理最低。群落均一性Heip、Shannoneven指数均为CK2最高，且明显高于其他处理，T4、T6、T7处理高于CK1，T8处理最低。谱系多样性指数PD以T9处理最高，T1处理其次，CK2排名第3。表明草莓连作后土壤真菌群落多样性降低，与对照CK1相比，不同处理后真菌群落多样性改变，其中T4处理多样性增加较为明显，但仍低于未连作的CK2。

表2 不同处理土壤真菌群落多样性指数

2.1.2 细菌群落多样性 土壤细菌群落通过高通量测序分析，从不同处理中获得了600 340个有效序列，并从序列中鉴定出3 829个OTU，被鉴定为38个门710个属。由表3可知，CK2土壤细菌群落丰富度、多样性、均一性、谱系多样性均明显低于其他处理，其次是T3、T7处理，之后是CK1、T2、T4处理。细菌群落丰富度指数Sobs、Chao、ACE均为CK2最低，其次是T7、T3处理，其后依次是T2、T4、CK1、T8、T6、T9处理。群落多样性指数Shannon、Simpson为CK2最低，其次是T7、T3处理，之后为T2处理、CK1，T9处理最高。群落均一性Heip、Shannoneven和谱系多样性指数均以CK2最低，T3、T7处理其次，之后是CK1、T2、T4处理。

表3 不同处理土壤细菌群落多样性指数

2.2 不同处理土壤真菌、细菌群落组成差异

2.2.1 真菌群落组成差异 不同处理土壤真菌群落中子囊菌门占主导地位，CK1、CK2、T1～T9处理中子囊菌门相对丰度分别为96.02%、53.43%、97.66%、98.51%、97.46%、94.01%、96.89%、96.17%、96.50%、99.28%、97.24%。其次是担子菌门、unclassified_k_Fungi、被孢霉门，CK2中占比最高，分别为20.21%、13.40%、12.84%，T7处理中担子菌门为3.11%、T4处理中unclassified_k_Fungi为4.53%，低于CK2，但高于其他处理(图1)。

土壤真菌群落中CK1、T1、T2、T3、T4、T5、T6处理主要真菌属是unclassified_f_Chaetomiaceae、热带头梗霉属，但T2、T4处理中以热带头梗霉属占主导，其他为unclassified_f_Chaetomiaceae占主导(图2)。CK2中占主导地位的是Apiotrichum(19.86%)、曲霉属(15.49%)、unclassified_o_Mortierellales(11.22%)、镰刀菌属(10.05%)、热带头梗霉属(6.93%)。T8、T9处理是unclassified_f_Chaetomiaceae占主导，但T9处理真菌群落结构不同于其他处理。CK1、CK2、T1～T9处理中unclassified_f_Chaetomiaceae占比分别为62.78%、2.46%、54.59%、21.77%、61.52%、36.25%、48.36%、55.73%、56.65%、82.51%、46.24%，被孢霉属占比分别为0.93%、1.62%、0.55%、0.53%、0.93%、1.18%、1.28%、1.22%、0、0、3.22%。表明连作改变土壤真菌结构，种类减少，比例失衡，以少数菌属为主。

根据不同处理土壤真菌OTU分布的Venn图分析发现，共有OTU有33种(图3)，CK2的特异性OTU最多，有114种，其次是T9处理，而CK1、T6、T7处理最少，仅3种独有OTU。表明连作减少了土壤中真菌种类和数量，不同处理方式稍有所改善。

2.2.2 细菌群落组成差异 根据图4可知，各处理土壤细菌群落中优势菌门为厚壁菌门、变形菌门、放线细菌门、绿弯菌门、酸杆菌门。土壤细菌群落中厚壁菌门、变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、螺旋体菌门均在CK2中占比最高，分别为37.94%、24.44%、14.72%、3.25%、1.04%，但CK2中放线细菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门的相对丰度低于CK1及其他各处理。其中CK1及各处理与CK2差异较大的菌门主要是厚壁菌门、放线细菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门。而各处理间及对照的优势菌门占比不一致，其中T3处理各菌门的占比规律与CK2较为相近。

根据图5可知，各处理细菌群落主要菌属为芽孢杆菌属、norank_c_Acidobacteria、norank_o_JG30-KF-CM45、norank_f_Anaerolineaceae、norank_f_Gemmatimonadaceae、微小杆菌、玫瑰弯菌属、硝化螺菌属、链霉菌属、类芽孢杆菌属。CK1、CK2、T1～T9处理中芽孢杆菌属占比分别为17.88%、20.58%、11.49%、13.09%、19.83%、14.52%、15.04%、16.32%、19.42%、13.27%、8.77%。CK2根际土壤中微小杆菌属、玫瑰弯菌属、硝化螺菌属、链霉菌属、类芽孢杆菌属占比低于其他处理，分别为1.40%、1.50%、0.30%、0.79%、0.73%，但芽孢杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、梭菌属stricto 13、梭菌属stricto 12、硫杆菌属占比最高，分别为20.58%、1.85%、5.81%、1.18%、1.17%。连作改变了土壤细菌群落的组成比例，不同处理间细菌群落组成差异较大，其中T3、T7处理细菌群落的变化规律与CK2更接近。

据图6可知，对照与各处理间共有的OTU 681种，其中CK2特有OTU最多，其次是T9处理。但CK2总的OTU数最少，T1处理最多。CK1细菌特有OTU共17种，CK2特有OTU主要有22种，稍较CK1多。说明连作后土壤中细菌种类减少，总量增加，这与细菌多样性分析结果一致。不同处理稍有不同，其中T7处理细菌总量减少，T9处理细菌种类增加。

2.3 不同处理土壤真菌、细菌群落结构差异

聚类分析树上不同分枝之间的距离反映了样本微生物之间遗传距离的大小。在OTU水平，采用Bray-Curtis距离算法对不同样本真菌群落相似性分析发现，CK2与CK1及其他处理间相似度低，差异大，CK1与T6、T3处理相似度高，与T8、T9、T2、T4处理相似度低(图7-A)。对不同样本细菌群落相似性分析发现，CK2与CK1及其他处理间相似度低，差异大，CK1与T1处理相似度高，与T9、T3、T7处理相似度低(图7-B)。

3 讨论

连作会导致植物根际土壤中微生物群落结构改变，土壤质量降低，病害加重，严重影响了经济效益。研究发现，连作后土壤微生物群落的结构及数量均会发生较大的变化[7]。随连作年限的延长，草莓根际土壤生态系统中，细菌和真菌群落各门类组成的比例会发生显著变化，根际土壤中细菌数量逐渐降低，真菌数量逐渐升高，细菌和真菌数量的比值逐渐降低，导致土壤微生物由“细菌型”向“真菌型”转变[26]。在棉花[27]、太子参[28]、苹果[29]等连作研究中也得出一致的结论。本研究中，草莓连作后改变了土壤真菌群落结构，种类减少，比例失衡，以少数菌属为主；细菌群落多样性升高，总量增加，种类减少，比例改变。本研究与众多研究者报道连作后细菌数量减少、真菌数量增加的规律有所差异。但在谭雪莲等对马铃薯连作研究中也发现，连作3年和5年土壤真菌数量分别减少了25.68%和 32.43%[30]。在地黄连作研究中发现，随着连作年限的增加，根际真菌减少，放线菌增多[31]。本试验不同处理后土壤中真菌、细菌群落稍有所改善，其中真菌以稻壳炭(T4)处理效果较为明显，细菌以秸秆炭(T3)处理和菌渣混土(T7)处理效果较为明显。

土壤微生物多样性是指微生物在遗传、种类和生态层次上的变化，即微生物群落的稳定性，可作为衡量土壤质量和评价土壤生态系统稳定的重要生物学指标[32-34]。本研究的高通量测序结果显示，不同处理根际土壤真菌、细菌群落丰富度、多样性、均匀度和系谱多样性等指数差异明显。真菌群落中T4处理群落多样性、均一性、谱系多样性指数均高于CK1，但低于CK2。细菌群落中CK2群落丰富度、多样性、均一性、谱系多样性均显著低于其他处理，其次是T3、T7处理，之后是CK1、T2、T4处理，最高的是T9处理。说明草莓连作后土壤真菌群落多样性降低，与CK1相比，不同处理后真菌群落有所改善，其中稻壳炭(T4)处理效果较为明显。由于稻壳炭结构疏松、多孔，容重低，施用稻壳炭于土壤后，土壤表面的理化性质会随时间而发生变化，且使土壤微生物生物量增加[35]，故稻壳炭处理效果较好于其他处理。生产上可混合施用稻壳炭、秸秆炭修复草莓连作大棚土壤。

本试验各处理真菌群落中子囊菌门占主导地位，其次是担子菌门、unclassified_k_Fungi、被孢霉门，其中CK2子囊菌门最低，其他优势菌门均较高于CK1、T1～T9处理。CK1、T1～T6处理主要真菌属是unclassified_f_Chaetomiaceae、热带头梗霉属，其中T2、T4处理中热带头梗霉属占主导，CK2中占主导地位的是Apiotrichum、曲霉属、unclassified_o_Mortierellales、镰刀菌属、热带头梗霉属。王晓宝等研究发现，被孢霉属的相对丰度与苹果连作障碍的严重程度呈显著性负相关，对植株的生长起促进作用[11]。本研究CK2中以曲霉属、unclassified_o_Mortierellales、镰刀菌属为优势菌属，被孢霉属占比最高，表明连作后土壤中有益真菌相对含量减少，将影响植株生长发育。本研究对不同样本真菌群落相似性分析发现，CK2与CK1及其他处理间相似度低、差异大，CK1与T6、T3处理相似度高，与T8、T9、T2、T4处理相似度低。表明连作前后真菌群落结构差异大，修复之后各处理间差异明显，但与未连作处理仍存在较大差异，需要进一步修复调控。

本试验各处理土壤细菌群落中优势菌门为厚壁菌门、变形菌门、放线细菌门、绿弯菌门、酸杆菌门，主要菌属为芽孢杆菌、微小杆菌、玫瑰弯菌属、硝化螺菌属、链霉菌属、类芽孢杆菌属等。CK1及各处理与CK2差异较大的菌门主要是厚壁菌门、放线细菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门。厚壁菌门中芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌在碳水化合物代谢中起着重要作用[36]。拟杆菌门细菌与有机物的吸收、利用关系密切，能够降解聚合物，是环境中碳循环的重要参与者[37]。变形菌、浮霉菌、放线菌等被认为是富营养菌[38]。绿弯菌门细菌倾向于生活在营养充足的环境中，大量的营养元素有利于其生长繁殖[39]。酸杆菌门细菌适合在有机碳含量低的酸性土壤中生存[40]。本研究中未连作的CK2中厚壁菌门、绿弯菌门、拟杆菌门占比高，而放线菌门、酸杆菌门和浮霉菌门占比少，说明连作之后土壤细菌群落改变，分解型细菌减少，富营养型细菌增加，连作土壤肥力营养充足，土壤酸性降低。芽孢杆菌属的很多菌都是有利于植物生长发育的促生菌，如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等[41]，本研究中未连作的CK2中芽孢杆菌属相对含量最高，其次是T3、T7处理，说明连作之后土壤中有益细菌含量减少。大棚草莓连作后改变了土壤细菌群落的组成比例，不同调控处理后土壤中细菌群落组成差异较大，其中秸秆炭(T3)处理和菌渣混土(T7)处理变化规律与CK2更接近，这与不同样本细菌群落相似性分析结果相吻合。

4 结论

(1)真菌群落中稻壳炭处理群落多样性、均一性、谱系多样性指数均高于CK1，但低于CK2。与对照CK1相比，不同处理后真菌群落有所改善，其中稻壳炭(T4)处理效果较为明显。(2)细菌群落中CK2群落丰富度、多样性、均一性、谱系多样性均明显低于其他处理，其次是T3、T7处理，其中秸秆炭(T3)处理优势菌门占比规律与CK2较为相似。(3)真菌群落CK1与T6、T3处理相似度高，与T8、T9、T2、T4处理相似度低。细菌群落CK1与T1处理相似度高，与T9、T3、T7处理相似度低。不同处理对草莓连作大棚土壤真菌、细菌群落稍有所改善，其中真菌以施稻壳炭效果较为明显，细菌以施秸秆炭和菌渣混土效果较为明显，生产上可混合施用稻壳炭、秸秆炭修复草莓连作大棚土壤。