三种检测方法在翠屏区牛结核病检疫中的应用

潘延乐，陈铭，王颖旺

（1.宜宾市翠屏区动物疫病预防控制中心 四川宜宾 644000；2.河南省信阳市动物疫病预防控制中心 河南信阳 464000）

牛结核病是由结核分枝杆菌引起的传染病，其病原菌可以广泛传播于人与牛之间，是重要的人畜共患病之一。世界动物卫生组织（WOAH）把该病列为B 类传染病，我国将其列为二类动物疫病[1]。该病是目前牛的重要传染病之一，严重危害奶牛养殖。感染谱较广，其中奶牛最易感，黄牛和耗牛次之，猪、鹿、猴、人均可感染。牛结核病根据感染靶器官的不同分为肠结核、肺结核、淋巴结核和乳腺结核四类，不同类型的结核病有不同的危害。其主要病理特征为各种组织器官出现肉芽肿胀、严重时出现干酪样坏死，甚至钙化。结核分枝杆菌根据病原菌的不同分为牛型、人型和禽型，且不同类型对靶动物的亲近性较强，而各种类型之间存在交叉感染。

在我国，牛结核病对奶牛养殖场的感染率较高，感染区域范围广，在我国大部分地区均有本病的报道[2]。发病无明显季节性，常年可发病，尤其是气候干燥、气温寒冷的冬天高发。牛结核分支杆菌属于胞内寄生菌，一般的抗生素对其无效，奶牛一旦感染，即使不发病也会终身带毒。这给奶农带来困扰，结核病能通过水源、饲料、空气、尘埃、痰液等直接或间接传播，也可以通过皮肤、唾液、注射器、刀具等接触传播，传播方式多样性给牛结核病净化带来很多现实困难。

牛结核病的诊断主要依据临床症状和流行病学特点来初步诊断，加以实验室确诊。实验室检测技术主要包括细菌分离鉴定、免疫学方法和分子生物学方法等[3]。这些检测方法各有优缺点，在牛结核病检疫和净化过程中需要根据实际情况选择合适的检测方法进行检测。

国外常用皮内变态反应和γ-干扰素体外释放试验进行检疫[4]，1990 年Wood 等[5]通过检测牛结核菌素刺激牛全血释放的γ-干扰素，阐明了诊断牛结核病的ELISA 方法。γ-干扰素（interferon gamma，IFN-γ）是活化的T 淋巴细胞和NK 细胞在特定抗原和丝裂原的刺激下产生的广谱抗肿瘤、抗病毒、抑制细胞增殖和免疫调节糖蛋白。γ-干扰素ELISA 试验和皮内变态反应是国家标准GB/T 18645—2020 中规定的牛结核病检测方法[6]，也是世界动物卫生组织规定的国际贸易制定使用的检测方法，翠屏区对辖区内的57 头奶牛分别用皮内变态反应试验、胶体金快速检测卡和γ-干扰素ELISA 试验进行了比对试验。

1 牛结核分枝杆菌皮内变态反应试验

1.1 试验材料

翠屏区辖区内的181 头奶牛信息见表1，本文中的奶牛养殖户用字母代替；提纯牛型结核菌素冻干粉PPD（BoPPD）购自中牧实业有限公司，批号为1908001，使用前按照说明书要求稀释；碘伏、注射器、刮毛刀、游标卡尺、保定绳等。

表1 翠屏区2022年牛结核病普查养殖户存栏量信息表

1.2 试验方法

在牛颈侧身中部偏上1/3 处将毛剃干净，直径约为10cm，用游标卡尺测量术部中央皮皱厚度，此为原始皮厚，做好原始记录。术部消毒后，注射稀释好的牛PDD 0.1mL；注射后局部会出现小疱；72h 后仔细观察局部有无肿胀、热痛等炎性反应，用游标卡尺测量皮皱厚度作为反应皮厚，并做好记录。

1.3 结果判定

计算出每头牛的皮厚差（皮厚差=反应后皮厚-初始皮厚）。阴性反应：皮厚差小于2.0mm，无炎性反应；阳性反应：皮厚差大于或等于4.0mm，局部有炎症反应；可疑反应：皮厚差大于或等于2.0mm但小于4.0mm，局部炎性反应不明显。

2 牛结核分枝杆菌γ-干扰素ELISA 试验

2.1 试验材料及仪器设备

用含有肝素钠的真空采血管进行无菌采血，采集上述牛全血样品每头约5mL，共57 份；牛结核病γ-干扰素ELISA 检测试剂盒，来源于武汉科前生物股份有限公司，试剂批号为20 220301；移液器、U形离心管、生物安全柜、37°C 恒温培养箱、酶标仪、洗板机等。

2.2 试验方法

1）全血采集及预处理。抗凝血需在5h 内送到实验室，避免冷冻。并对血样编号，将试管缓慢颠倒充分混匀血液样品进行分装。在无菌条件下将抗凝血分别加入U 形离心管，每份血样加3 孔，500μL/孔。

2）加入刺激抗原。在无菌条件下分别向相应的U 型管中加入100μL PBS、100μL 牛PPD、100μL 禽PPD，为保证抗原与血液充分混合，在微量振荡器上轻微振荡1min 左右。将U 形管置于37°C 恒温培养箱中培养16～24h。

3）收取上清液。孵育结束，将U 形离心管置于离心机中，2,000rpm离心5min，之后用移液器从每孔吸取约100μL 上清液转入96 孔包被板中。

4）牛γ-干扰素ELISA 试验。将其他相关试剂进行室温平衡。按照样本布局表加入获取的上清样本100μL/孔；同时设阴性对照和阳性对照各2 孔，37℃孵育45min。洗涤：倒掉孔内液体，每孔加入300μL 工作浓度的洗涤液，重复洗涤4 次，最后一次在吸水材料上拍干。加入酶标结合物：每孔加入100μL 兔抗牛γ-干扰素多克隆抗体，37℃孵育30min。洗涤：如上洗涤4 次。加入底物：每孔依次加入50μL 底物A 溶液和50μL 底物B 溶液，震荡混匀，于室温（20～25℃）下避光显色10min。加入终止液：每孔加入50μL 终止液，轻轻震荡混匀，10min 内在酶标仪上测量各孔OD630nm值。

5）结果判定：阳性对照OD630nm平均值≥0.5，阴性对照OD630nm＜0.3，试验成立。计算各样品的OD 值，阳性：牛PPD 的OD 值-禽PPD 的OD 值≥0.2 且禽PPD 的OD 值-阴性抗原OD 值≥0.2，其他情形均判为牛结核病阴性。

3 胶体金检测方法

3.1 试验材料及方法

布鲁氏菌抗体快速检测卡来源于上海快灵生物科技有限公司，批号为G220601310，全血样品为步骤2 中的抗凝全血。吸管吸取全血，将1 滴全血样品滴入稀释管中，轻轻吸混匀，用吸管吸取检测液，在加样孔上方垂直滴加2 滴。45s 内测试窗口无液体移行，需追加1 滴检测液。室温条件下静置5min 观察结果，超出10min的结果无效。

3.2 判定标准

在检测试纸条上C 线和T 线均出现色带为布鲁氏菌抗体阴性，试纸条上C 线显示红色颜色条带，为布鲁氏菌抗体阳性，在检测试纸条上C 线不显示色带，无论T 线是否显示红色色带，均判为无效结果。

4 试验结果

4.1 检测阳性率的比较分析

用皮内变态反应试验对57 头奶牛进行检测，出现8 头阳性奶牛，个体阳性率为14.03%（8/57），对57 头奶牛全血进行刺激培养和γ-干扰素ELISA 试验进行检测，结果显示γ-干扰素ELISA 方法检出阳性样品1 份，阳性率为1.75%（1/57），胶体金快速检测卡试验阳性率为29.82%，见表2。

表2 不同方法检测阳性率统计结果

4.2 皮内变态反应与γ-干扰素ELISA 检测方法比较结果

对57 份样品用γ-干扰素ELISA 检测与皮内变态反应方法进行比对，结果表明：皮内变态反应试验检出阳性8 头，γ-干扰素ELISA 方法检出阳性1 头，两种方法检出的双阳性牛为1 头，双阴性牛为49 头，两者之间的敏感性为100%（1/1），特异性为87.5%（49/57），符合率为87.72%（50/57）（表3）。

表3 皮内变态反应与γ-干扰素ELISA方法检测比较结果

4.3 三种不同的方法结果的比较

用三种不同的方法对翠屏区57 头奶牛进行牛结核病检测，结果如表4，用皮内变态反应对57 头奶牛进行初筛，对检测阳性和可疑奶牛经过胶体金快速检测卡和γ-干扰素ELISA 试验复检，确诊1 头牛为结核病阳性牛。

表4 三种方法牛结核病检测结果

根据表中结果统计，三种方法均为阳性的有1 头，均为阴性的有42 头，总符合率为75.44%（43/57）。γ-干扰素ELISA 方法与PPD相比，牛结核菌素均为阳性的为1 头，阳性符合率为12.5%（1/8）。胶体金检测与PPD 相比，均为阳性的6 头，阳性符合率为75%（6/8），阴性符合率为83.67%（41/49），说明胶体金检测方法特异性较强，可以用于引种时的快速检疫。γ-干扰素ELISA 方法与胶体金检测相比，均为阳性的1 头，阳性符合率为16.67%（1/6）。

5 讨论

5.1 牛结核分枝杆菌皮内变态反应试验

181 头牛中对57 头奶牛进行了皮内变态反应试验，这并不排除181 头奶牛中剩余的124 头奶牛没有牛型结核分枝杆菌或禽型结核分枝杆菌或两者兼而有之的可能性，早期感染结核病的奶牛在3～6 周后才能出现变态反应，这可能会导致皮内变态结果是阴性或可疑结果[7]；也可能迟发型超敏反应对慢性感染动物的敏感性低，结核菌素试验会产生假阴性结果。因此，上述牛并不能完全排除早期感染或慢性感染的可能性，仅依靠结核菌素皮内变态反应试验来根除牛群中的结核病是不科学的。

5.2 胶体金快速检测卡

胶体金快速检测卡是检测感染牛血清或血浆中结核分枝杆菌产生的抗体，从而显示出视觉可判定的结果。这种方法操作简便，敏感性和特异性高，时效性强，适合基层检疫工作使用，但缺点是试剂盒较贵，检测成本高。

5.3 γ-干扰素ELISA 抗体试验

三种方法均为评价细胞免疫功能的试验[8]，通过不同型的PPD刺激红细胞产生γ-干扰素进行判定，可以排除禽分枝轩菌对牛引起的非特异性反应。本试验中皮内变态反应试验阳性检出率高于胶体金快速检测卡和γ-干扰素ELISA 试验，很可能与结核菌素皮内变态反应存在假阳性有关。

5.4 γ-干扰素ELISA 试验相对优势

牛PPD 试验在实际操作过程中，存在许多不确定性和主观因素，结果判定不易标准化，比较繁琐费时，需要术后72h 才能观察结果，导致在诊断过程中出现系统性误差的可能性较大，但其价格最低、操作简便，适用于大规模的监测。γ-干扰素ELISA 试验只需保定一次动物，省时省力，可检测出早期感染结核病的牛，并且判定标准为可量化的数据，实验结果科学客观。同时，γ-干扰素ELISA 试验还克服了结核菌素皮内变态反应容易出现假阳性和假阴性的不足，提高了试验的特异性[9]。

目前，国外许多国家如英国、欧盟等，在牛结核病防治计划中使用γ-干扰素试验增强特异性，两种试验并行进行，可增强敏感性，最大程度检测感染动物，消除假阳性牛，现正被农业部确定为牛结核病监测工作中的可靠方法，具有广阔的应用前景。

6 结论

精准的诊断出感染牛结核分枝杆菌，对牛结核病的控制和净化至关重要。从本试验的结果来看，若单独使用皮内变态反应检出的PDD 阳性牛就进行扑杀，必然造成假阳性牛被误杀，给养殖户造成巨大损失。

随着人类社会的发展，人们对奶制品的安全要求越来越高，在引进奶牛的同时也容易把疫病带入，带病牛持续排毒，污染环境，感染健康的奶牛，造成恶性循环，针对这种情况，翠屏区在2000 年左右就开始牛结核病监测，并且对每年检出的阳性牛进行了无害化处理，持续不断地监测，让翠屏区的奶牛结核病处于相对安全的状态，但以往的监测复查均采用的是牛型结核菌素皮内变态反应方法，假阳性和假阴性检出率较高，本次试验在省级有关部门的指导下做了皮内变态反应、快速检测卡和γ-干扰素ELISA 抗体对比试验。通过本试验，认为牛结核菌素试验适合大规模初筛，快速检测卡适用于引种快速检疫，而要进一步确诊还需要用γ-干扰素ELISA 抗体检测方法。

要想彻底净化奶牛结核病，须得做到以下几点：①严惩非法引种，对非法从疫区引种的人员进行严惩；②严格落实引进检疫政策，禁止引进免疫区和有疫病史的牛，强化落地检疫政策，倡导自繁自养；③定期开展结核病筛查，对监测阳性牛，立即组织扑杀，并且按照《病死及病害动物无害化处理技术规范》做无害化处理；④养殖场（户）要严格实施生物安全措施，防止外界致病菌进入到养殖场，对从外部引入的牛，要严格做好隔离检疫工作。