氧化亚铜准球形聚集体的合成及其抗菌性能

张晓辉　胡英　黄飞桥　吕路明　彭志勤　颜志勇

摘 要： 以廢弃葡萄果肉提取物（Waste grape pulp extract， WGPE）为还原剂，采用液相还原法将硫酸铜还原成氧化亚铜准球形聚集体（Cu2O-SA），借助傅里叶变换红外光谱仪、X射线薄膜衍射仪、X射线光电子能谱、扫描电子显微镜和场发射透射电子显微镜等表征分析Cu2O-SA的化学结构和形貌，测定反应条件对Cu2O-SA形貌和粒径的影响，并评价Cu2O-SA的抗菌效果。结果表明：以WGPE替代葡萄糖为还原剂或提高WGPE的浓度均有利于Cu2O-SA的合成；提高还原剂浓度和反应温度可使Cu2O-SA的粒径变小，粒径分布区间变窄，比表面积增大；Cu2O-SA是通过晶粒团聚生长并相互融合形成的多晶粉末，且随着生长时间的增加Cu2O-SA会发生聚集和表面重建；Cu2O-SA对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌质量浓度均在3.125～6.250 g/L。该研究对氧化亚铜纳米颗粒的合成和抗菌领域的应用具有指导意义。

关键词： 氧化亚铜；准球形聚集体；液相还原法；废弃葡萄；还原糖；抗菌

中图分类号： TQ131.2

文献标志码： A

文章编号： 1673-3851 （2023） 11-0681-10

引文格式：张晓辉，胡英，黄飞桥，等.氧化亚铜准球形聚集体的合成及其抗菌性能［J］. 浙江理工大学学报（自然科学），2023，49（6）：681-690.

Reference Format： ZHANG Xiaohui， HU Ying， HUANG Feiqiao， et al. Synthesis and antibacterial properties of cuprous oxide quasi-spherical aggregates［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2023，49（6）：681-690.

Synthesis and antibacterial properties of cuprous oxide quasi-spherical aggregates

ZHANG Xiaohui1， HU Ying2， HUANG Feiqiao1， L Luming1， PENG Zhiqin1， YAN Zhiyong2

（1.School of Materials Science & Engineering， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China; 2.College of Materials and Textile Engineering， Jiaxing University， Jiaxing 314000， China）

Abstract：  With waste grape pulp extract （WGPE） as a reducing agent， copper sulfate was reduced to cuprous oxide quasi-spherical aggregates （Cu2O-SA） by liquid phase reduction method. The chemical structure and morphology of Cu2O-SA were analyzed by Fourier transform infrared spectrometer （FT-IR）， X-ray diffraction （XRD）， X-ray photoelectron spectroscopy （XPS）， scanning electron microscope （SEM）， and field emission transmission electron microscope （TEM）， and the effects of reaction conditions on the morphology and particle size of Cu2O-SA were measured. Finally， the antibacterial effect of Cu2O-SA was evaluated. The results indicate that using WGPE as a reducing agent instead of glucose or increasing the concentration of WGPE is beneficial for the formation of Cu2O-SA. Increasing the concentration of the reducing agent and reaction temperature can reduce the particle size of Cu2O-SA， narrow the particle size distribution range， and increase the specific surface area. Cu2O-SA is a polycrystalline powder formed by the aggregation and fusion of grains， and as the growth time increases， Cu2O-SA undergoes aggregation and surface reconstruction. The minimum inhibitory concentration of Cu2O-SA against both Staphylococcus aureus and Escherichia coli ranges from 3.125 g/L to 6.250 g/L. This study is of great significance for the synthesis of cuprous oxide nanoparticles and their application in the antibacterial field.

Key words： cuprous oxide; quasi-spherical aggregates; liquid phase reduction method; waste grapes; reducing sugar; antibacterial

0 引 言

近年来，细菌的耐药性受到了广泛的关注，氧化亚铜（Cu2O）作为一种新型抗菌剂可有效解决细菌耐药性的问题［1-2］，Cu2O与细菌接触期间释放Cu2+和活性氧来杀死细菌，并且细菌在铜表面难以形成保护性生物膜，因此Cu2O相比其他金属纳米材料表现出更好的抗菌活性［3］。

Cu2O的抗菌活性受比表面积和形貌影响，粒径较小的Cu2O抗菌活性较好，球体的抗菌活性优于立方体［4］。Cu2O晶体在形态演变过程中会形成具有较高比表面积的氧化亚铜准球形聚集体（Cu2O-SA）［5］，具有较好的抗菌活性。Cu2O-SA的比表面积受粒径影响，通过改变原料的摩尔比、反应温度和表面活性剂等参数，可以获得不同粒径的Cu2O-SA［6-10］。因此，探究Cu2O晶体的生长过程和反应条件有助于合成比表面积更大的Cu2O-SA。

香蕉和甘蔗渣等含糖水果提取物中含有丰富的还原糖，利用含糖水果提取物可合成Cu2O晶体［11-12］。该方法使Cu2O晶体表现出更好的生物相容性［13］，从而拓展了其作为抗菌剂在生物医药等领域的应用。葡萄水果中也含有丰富的葡萄糖和果糖等还原糖，同时还含有多酚、类黄酮和有机酸等植物活性成分［14］，因此废弃葡萄果肉提取物（Waste grape pulp extract， WGPE）有望作为合成Cu2O晶体的还原剂。

本文以WGPE为还原剂，通过液相还原法合成Cu2O-SA，同时探究了反应温度和还原剂及其浓度对Cu2O-SA形貌和粒径的影响，并分析Cu2O-SA的微观生长过程，最后评价了Cu2O-SA的抗菌性能，论文结果为Cu2O晶体的形貌粒径控制与抗菌性能研究奠定理论基础。

1 实验方法

1.1 实验试剂

五水硫酸铜（CuSO4·5H2O，分析纯，99%），氢氧化钠（NaOH，97%），D-无水葡萄糖（C6H12O6，99%），肉汤培养基（10 g/L蛋白胨、5 g/L牛肉膏和5 g/L氯化钠）和琼脂培养基（10 g/L蛋白胨、5 g/L牛肉膏、5 g/L氯化钠和15 g/L琼脂粉）均购自上海麦克林生化科技有限公司；自制废弃葡萄果肉提取物（WGPE，29.1 mmol/L葡萄糖、30.9 mmol/L果糖）；第二代金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均购自上海鲁微科技有限公司。

1.2 氧化亚铜的合成

配制300 mL摩尔比为1.0∶12.5的五水硫酸铜、氢氧化钠二元溶液，在磁力搅拌下缓慢加热至40、60 ℃和80℃时加入WGPE，反应10 min后迅速冷却使反应停止；离心所得的沉淀物用去离子水和乙醇反复洗涤，最后湿态样品通过真空干燥后密封备用。反应条件设计如下：

控制还原剂浓度和反应温度不变，分别用1.08 g葡萄糖和10 mL WGPE作为还原剂，葡萄糖实验组记为GL01，WGPE实验组记为WG01。

控制还原剂和反应温度不变，改变还原剂浓度（0.01、0.02、0.03 mol/L和0.04 mol/L），设置实验组分别记为WG02、WG03、WG04和WG05。

控制还原剂和还原剂浓度不变，改变反应温度（40、60℃和80℃），设置实验组分别记为WG06、WG03和WG01。

氧化亚铜的具体合成参数见表1。

1.3 表征方法

采用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）在400～4000 cm-1的范围内分析样品的官能团结构；采用X射线薄膜衍射仪（XRD）在2θ为20°～90°范围内分析样品的晶体结构；采用X射线光电子能谱（XPS）分析样品的元素组成和化学价态；采用扫描电子显微镜（SEM）观察样品的形貌和粒径；采用200 kV场发射透射电子显微镜（TEM）观察样品的晶面和晶面间距；采用分光光度计法和酶法等方法测定WGPE中还原糖浓度，具体方法参考文献［15-16］。

1.4 抗菌性能

抑菌圈测定：以细菌纤维素膜为载体，使用打孔器将复合膜裁剪成直径为5 mm的圆形膜，对样品进行抑菌圈测定。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在肉汤培养基中30 ℃活化24 h，将活化后的菌液稀释至108个/mL。加热琼脂培养基，并倒入培养皿中冷却凝固，移取100 μL稀释后的菌液于琼脂培养基表面，并用无菌三角涂布棒涂抹均匀，最后将圆形复合膜贴于培养基表面，30 ℃倒置培养16 h。

最小抑菌浓度测定：配制质量浓度50 mg/mL Cu2O悬浮液，取用1～9号无菌试管，每管加入1 mL无菌肉汤培养基。1号试管中加入1 mL Cu2O悬浮液，混匀后取出1 mL加入到2号试管中，依次梯度稀释至7号试管。然后向1～7号试管中依次加入100 μL稀释后的菌液，8号试管不加菌液作为对照，9号试管不加Cu2O悬浮液作为对照。将1～9号试管30 ℃培养16 h，然后每个试管移取100 μL培养液于琼脂培养基表面并涂抹均匀，30 ℃倒置培养16 h后记录结果。

2 结果与讨论

2.1 Cu2O-SA的化学结构分析

图1为不同还原剂合成的样品GL01和WG01的FT-IR图。2个样品具有相似的红外吸收峰，表明采用WGPE合成的样品与葡萄糖合成的具有相似的官能团结构（图1（a））。放大图1（a）中560～680 cm-1吸收带（图1（b）），结果显示：2种材料分别在623 cm-1和619 cm-1处显示出特征吸收峰，对应于Cu—O键的伸缩振动，且样品WG01较样品GL01发生轻微红移，归因于样品粒径的增加［17］。因此，采用WGPE作为还原剂合成的樣品与葡萄糖合成的样品在官能团结构上相比无显著差异。

图2为不同还原剂、还原剂浓度和反应温度下合成的样品的XRD图。不同反应条件下合成的样品均具有（110）、（111）、（200）、（220）和（311）特征衍射面，与赤铜矿的标准图谱（PDF 05-0667）一致，且未观察到CuO或Cu的特征衍射面（图2），表明不同反应条件下合成的样品均具有相同的晶体结构。使用式（1）计算样品GL01和WG01的晶粒尺寸：

D=λ×κb×cosθ（1）

其中：D是晶粒尺寸，nm；κ是Scherrer常数，1.075；λ是X射线波长，1.5405 ；θ是布拉格角，（°）；b是峰的半峰全宽（FWHM），rad。经过计算，GL01和WG01的晶粒尺寸分别为3.48 nm和4.05 nm，表明反应过程中均有小晶粒的形成。

通过X射线光电子能谱对样品WG01进行元素和价态分析，结果如图3所示。样品WG01主要存在Cu和O两种元素（图3（a））。图3（b）为Cu 2p的高分辨率谱图，其中932.68 eV和952.8 eV处的峰分别与Cu 2p3/2和Cu 2p1/2的结合能相关，因此样品WG01可能为单质铜或一价铜，同时在946.1 eV处存在微弱的宽卫星峰，主要是由于样品表面存在微量的Cu2+。为了进一步分析样品WG01中Cu元素的价态，分析样品中Cu元素的俄歇谱，并通过式（2）计算俄歇谱峰的动能为916.5 eV，表明样品WG01主要为Cu+产物［18］（见图3（c））。

综上所述，结合官能团、晶体结构、元素组成和化学价态的分析结果可以得出，利用还原剂WGPE合成的晶体样品为Cu2O。

hν=Ek+Eb+Er（2）

其中：hv为X射线源光电子的能量，1486.6 eV；Ek为俄歇谱峰的动能，eV；Eb光电子的结合能，eV；Er为原子的反冲能量，eV。

2.2 Cu2O-SA的形貌分析

图4为不同反应条件下合成Cu2O的SEM图和粒径分布区间图。样品GL01呈类立方体和类球形形貌，平均粒径（AD）为665 nm（图4（a））。样品WG01具有规则球形形貌，平均粒径为766 nm（圖4（b））。球形形貌的形成主要与反应溶液的pH相关，Cu2O的（111）和（110）晶面中的Cu原子上的悬空键使晶面带正电［19］，反应体系中的OH-通过与悬空键结合从而稳定晶面并阻碍晶粒的团聚生长。WGPE中的果酸可以中和反应体系中的OH-，降低反应体系的pH值（表2），使得晶核向各个晶面均匀生长并且促使晶核聚集生长形成球形和多晶形貌。从样品WG02中可以观察到不规则形貌，平均粒径为1255 nm（图4（c））；WG03和WG04中均可观察到类球形形貌，平均粒径分别为1230 nm和1178 nm（图4（d）—（e））；样品WG05为球形形貌，平均粒径为519 nm（图4（f））。随着WGPE浓度的增加反应体系的pH值下降，样品的形貌逐渐从不规则向球形转变，同时样品WG02相比WG03粒径并没有明显减小，但粒径分布区间却明显变窄，是由于随着还原剂浓度增加成核时间减少，晶核的生长逐渐同步。从样品WG06中观察到粒径分布区间较宽的类球形形貌，平均粒径为891 nm（图4（g））。结合样品WG03和WG01的粒径及其分布区间，可以得出随着温度的增加Cu2O-SA的粒径分布区间逐渐变窄，这是由于反应温度的增加会提高Cu+的浓度，从而促使晶核爆发式形成，晶核趋向同步生长。因此，随着还原剂浓度和反应温度的增加，Cu2O-SA的粒径分布区间逐渐变窄，粒径逐渐减小，使得比表面积逐渐增大。

图5为样品WG01的TEM、SAED和HRTEM图。样品WG01是粒径约为700 nm的Cu2O-SA（图5（a））。在样品WG01的选区电子衍射图中观察到Cu2O-SA的多晶衍射环，说明样品为多晶粉末，并显示了Cu2O-SA的（110）、（111）和（220）晶面（图5（b）），与样品XRD分析中所观察的衍射面一致。样品WG01的HRTEM图显示了结构均匀的（111）和（220）晶面，面间距D分别为0.25 nm和0.15 nm（图5（c）—（d）），与赤铜矿图案（PDF 05-0667）的（111）和（220）晶面间距相一致。

2.3 Cu2O-SA的微观生长过程分析

图6为Cu2O-SA的生长过程SEM图。反应开始阶段反应体系中存在大量纳米粒子，纳米粒子向晶核聚集使得晶核缓慢生长，晶核的数量受Cu+的浓度影响，而Cu+的浓度会随着还原剂浓度的增加和反应温度的升高而增加（图6（a））。纳米粒子聚集生长后形成晶粒，并且发生聚集，或者较小的晶粒吸附在较大的晶粒上（图6（b）），聚集的晶粒不断生长并出现融合现象（图6（c）），与TEM分析中观察到的多晶衍射环相一致，晶粒聚集融合后形成了700 nm左右的Cu2O-SA（图6（d）），其粒径大小和粒径分布区间受晶核形成时间和晶核生长时间共同影响。根据Lamer模型［20］，Cu+浓度到达Cmin时开始成核阶段，直到Cu+浓度再次低于Cmin时成核阶段结束，晶核浓度C高于溶解度Cs时为晶核的生长阶段，成核阶段时间过长就会导致不同时间点形成的晶核生长不同步，将导致Cu2O-SA的粒径变大和粒径分布区间变宽。最后Cu2O-SA通过团聚和表面重建进一步生长为氧化亚铜多晶六足体（图6（e）—（f））。

2.4 Cu2O-SA的抗菌性能

以纯纤维素膜为载体对样品GL01、WG03、WG04和WG05进行抑菌圈测定，图7为样品GL01、WG03、WG04和WG05对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈测试照片，其中纯纤维素膜为空白对照组。结果表明纯纤维素膜对2个菌种均无抑菌圈，而样品GL01、WG03、WG04和WG05对2个菌种均产生明显的抑菌圈（图7）。

样品GL01、WG03、WG04和WG05对大肠杆菌的抑菌圈直径分别为0.75、0.98、0.99 cm和1.10 cm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为0.78、1.20、1.30 cm和1.50 cm（表3）。因此，纯纤维素膜无抗菌活性，Cu2O-SA具有抗菌活性，其中WG05对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果最好，且Cu2O-SA对金黄色葡萄球菌的抗菌效果普遍优于大肠杆菌。

图8为样品GL01和WG05对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）测试照片。从样品GL01对金黄色葡萄球菌的MIC测试照片中，观察到样品质量浓度3.125 g/L的培养皿中出现了菌落生长（图8（a））；从样品GL01对大肠杆菌的MIC测试照片中，观察到样品质量浓度6.25 g/L的培养皿中出现了菌落生长（图8（b））；在样品WG05对金黄色葡萄球菌的MIC测试照片中，观察到样品质量浓度3.125 g/L的培养皿中出现了菌落生长（图8（c））；在样品WG05对大肠杆菌的MIC测试照片中，观察到样品质量浓度3.125 g/L的培养皿中出现了菌落生长（图8（d））。因此，样品GL01对金黄色葡萄球菌的MIC在3.125～6.250 g/L，而对大肠杆菌的MIC浓度在6.25～12.50 g/L，样品WG05对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC均在3.125～6.250 g/L。样品WG05相比GL01抗菌活性获得了一定的提高，其原因可能是样品WG05粒径小于样品GL01，导致样品WG05的有效比表面积高于样品GL01。

3 结 论

本文使用液相还原法合成了Cu2O-SA，通过FT-IR、XRD和XPS分析了Cu2O-SA的化学结构，通过SEM和TEM观察了Cu2O-SA的形貌，最后测试了Cu2O-SA的抗菌性能，主要研究结果如下：

a）以WGPE为还原剂成功合成了Cu2O-SA，并且利用WGPE替代还原剂葡萄糖和提高WGPE的浓度均会引起反应体系pH值的下降，进而促使样品形貌向球形转变。

b）提高还原剂浓度和反应温度会缩短晶核的形成时间，使Cu2O-SA的粒径减小，粒径分布区间变窄，比表面增大。

c）纳米粒子向晶核聚集生长形成晶粒，晶粒团聚生长并相互融合形成Cu2O-SA多晶粉末，最后随生长时间增加Cu2O-SA开始聚集和表面重建生长为Cu2O晶体。

d）Cu2O-SA对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有良好的抗菌效果，最小抑菌浓度均在3.125～6.25 g/L，且Cu2O-SA对金黄色葡萄球菌的抗菌效果要优于大肠杆菌。

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（责任编辑：廖乾生）

收稿日期： 2023-02-08网络出版日期：2023-06-07

基金项目： 浙江省基础公益研究计划项目（LGG21E030011）；嘉兴市科技计划项目（2020AY10014）

作者简介： 张晓辉（1997- ），男，浙江嘉兴人，硕士研究生，主要从事新纤维材料及功能性纤维材料方面的研究。

通信作者： 颜志勇，E-mail：yzyong77@zjxu.edu.cn