野野村放线菌DB-3-04产达巴万星前体A-40926 B0发酵培养基优化

李文科 张仁文 万传星

摘要：目的 优化野野村放线菌产达巴万星前体A-40926 B0的发酵培养基配方。方法 在单因素试验的基础上通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验以及Box-benhnken响应面法设计优化A-40926 B0发酵培养基，使用Design Expert 13.0对实验数据进行分析。结果 培养基各成分中影响A-40926 B0产量的4个主要因素是麦芽糊精、黄豆饼粉、酵母浸粉和鱼蛋白胨，其最佳浓度分别为38.18、46.00、21.29和6.06 g/L，A-40926 B0产量达到2379.67 mg/L。结论 经优化后，A-40926 B0的摇瓶产量较原始培养基产量提高了281.39%，为后期发酵罐中试与生产提供了重要参考。

关键词：达巴万星，野野村放线菌DB-3-04，响应面法

中图分类号：R978.1+6 文献标志码：A

Optimization of fermentation medium for the production of dalbavancin precursor A-40926 B0 by Nonomuraea sp. DB-3-04

Li Wenke1，2 Zhang Renwen2， and Wan Chuanxing1

（1 State Key Laboratory Breeding Base for the Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin Co-funded by Xinjiang Production & Construction Corps and The Ministry of Science & Technology/College of Life Science and Technology， Tarim University， Alar 843300; 2 Hubei HONCH Pharmaceutical Co.， Ltd.， Huanggang 438000）

Abstract Objective The objective of this study was to optimize the fermentation medium formulation of the dalbavancin precursor A-40926 B0 from Nonomuraea sp. DB-3-04. Methods The fermentation medium for producing A-40926 B0 was optimized by Plackett-Burman test， steepest climb test and Box-benhnken response surface method on the basis of single factor test， and the experimental data were analyzed by Design Expert 13.0. Results The four main factors affecting the yield of A-40926 B0 in the various components of the medium were maltodextrin， soybean cake powder， yeast impregnated powder and fish peptone. The optimal concentrations were 38.18， 46.00， 21.29 and 6.06 g/L， respectively， and the yield of A-40926 B0 reached up to 2379.67 mg/L. Conclusion The yield of A-40926 B0 after optimization was increased by 281.39% compared with the yield of the original medium， which provided an important reference for the pilot and production of later fermentation tanks.

Key words Dalbavancin; Nonomuraea sp. DB-3-04; Response surface method

達巴万星（dalbavancin）是1种新型半合成糖肽抗生素[1]，由A0、A1、B0、B1和B2等5种化学物质组成，其中主要成分为B0，占比为90%[1-2]。达巴万星由Durata公司研发，于2014年5月获得FDA的批准，用于治疗成人急性细菌性皮肤和皮肤结构感染（ABSSSI）[3]。前体A40926最初是从野野村放线菌Nonomuraea sp. ATCC39727发酵产生的1种天然糖肽类抗生素[4]。结构和活性与替考拉宁相似[5]，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和链球菌表现出有效的活性，对维持其他抗菌药物的有效性和减少耐药性细菌的产生也有显著效果[6-8]。

微生物产生次生代谢物高度依赖于存在的菌株及其培养基组分和培养条件。培养基组成的微小变化可以显著影响次级代谢物的产量和微生物的生长代谢。培养基的设计与优化对于提高抗生素产量至关重要[9]。响应面方法（response surface methodology，RSM）是通过应用数学和统计学来优化发酵过程参数的重要方法和有效工具[10-11]。使用响应面优化发酵条件主要基于以下实验[12]：使用Plackett-Burman设计来确定显著影响发酵过程的因素；通过最陡爬坡试验确定显著因素的大致范围；运用Box-Behnken试验设计以建立发酵模型并确定最佳发酵条件。响应面法已被广泛用于优化微生物发酵过程，它可以快速确定多种因素对发酵产物收率的影响。

本研究在单因素试验的基础上通过Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验以及响应面法设计优化达巴万星前体A-40926 B0发酵培养基，以期为后续的发酵罐中试和生产提供重要参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供试菌株为Nonomuraea sp. DB-3-04 （本实验室保藏）。

1.1.2 培养基种类和成分

固体培养基（g/L）：葡萄糖10，可溶性淀粉20，酵母提取物5，胰酪蛋白胨5，碳酸钙1，琼脂18，pH 7.5。

种子培养基（g/L）：玉米淀粉15，蛋白胨8，葡萄糖15，酵母浸粉10，硝酸钾1，七水硫酸镁1，碳酸钙3，pH 7.0～7.2。

初始发酵培养基（g/L）：葡萄糖15，黄豆饼粉20，麦芽糊精20，酵母浸粉15，七水硫酸镁2，碳酸钙3，pH 7.0。

1.1.3 主要仪器和试剂

生化培养箱（BJPX-350-1型，济南鑫贝西生物技术有限公司），恒温恒湿摇床（HZQ-QB型，苏州威尔实验用品有限公司），高效液相色谱仪（UltiMate3000型，美国Thermo公司），色谱柱（ODS-2HypersilTM C18，250 mm×4.6mm，5 μm），A-40926 B0标准品（上海麦克林生化科技股份有限公司），葡萄糖、麦芽糊精（秦皇岛骊骅淀粉股份有限公司），酵母浸粉（北京奥博星生物技术有限责任公司）、鱼蛋白胨（安琪酵母股份有限公司），黄豆饼粉（青岛科瑞培养基有限公司），L-缬氨酸（上海麦克林生化科技股份有限公司）。

1.2 培养条件

将保藏的菌种由甘油管接种到斜面或平板培养基，于恒温培养箱中，28 ℃培养7～14 d，然后将新鲜的斜面用竹签刮取1 cm2大小菌体转接至种子培养液中，装液量30 mL（250 mL三角瓶）于28 ℃、260 r/min的摇床上培养72 h左右，以10%（V/V）接种量，将培养好的种子液转接至装有30 mL发酵培养基250 mL三角瓶中于28 ℃、270 r/min的摇床上培养9 d后终止摇瓶发酵，取样进行检测分析，方法见“1.4”。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确称取A-40926 B0标准品溶解于50%乙腈中，制成浓度为500 mg/L的A-40926 B0标准品母液，将其稀释至25、50、100、125、175、200和250 mg/L。用于绘制A-40926 B0标准曲线。

1.3.2 单因素试验

以初始发酵培养基为基础培养基，固定氮源不变筛选碳源，进一步考察碳源复配和最佳浓度配比，继续筛选氮源和考察氮源复配和最佳浓度配比，然后进行无机盐和氨基酸种类筛选，进一步考察最佳浓度，最后考察烟酸对A-40926 B0发酵产量的影响。

1.3.3 Plackett-Burman试验设计

根据A-40926 B0的发酵特点和单因素试验结果，以影响A-40926 B0发酵的9个因素（葡萄糖、麦芽糊精、黄豆饼粉、酵母浸粉、鱼蛋白胨、七水硫酸镁、硫酸亚铁、L-缬氨酸、烟酸）作为PB设计的9个因子（A、B、C、D、E、F、G、H、J），每个因素选取2个水平，在初始发酵培养基的基础上取低水平（-1）和高水平（+1）。实验選用n=11的PB设计，设置2个虚拟项做误差分析，试验重复3次取平均值，试验因素水平设计见表1。

1.3.4 最陡爬坡试验

根据Plackett-Burman试验结果，设计显著影响因子合适的步长和爬坡方向，其他因子的浓度为初始添加浓度，试验重复3次取平均值，以此找到响应面试验的中心点。

1.3.5 响应面设计

根据最陡爬坡试验确定的中心点，通过Box-Benhnken试验设计针对显著影响因子设计4因素3水平的响应面分析实验，重复3次取平均值。

1.4 分析方法

发酵液中A-40926 B0测定方法：取培养好的发酵液用5 mol/L氢氧化钠溶液调至pH 12，取发酵液5 mL，用相同体积甲醇浸提，超声30 min，8000 r/min离心10 min，上清液经膜过滤进行HPLC分析。液相条件为流动相A：乙腈：水=1：9（1000 mL流动相A含1.54 g醋酸铵）；流动相B：乙腈，流速：1 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：10 μL；柱温：40 ℃。梯度洗脱0～11 min，B浓度变化18%～32%；11～15 min，B浓度变化32%～18%。运行时间21 min[13]。

1.5 数据处理

采用Design Expert 13.0软件进行Plackett-Burman试验和BBD响应面优化的实验设计和数据处理。

2 结果与分析

2.1 达巴万星前体A-40926 B0标准曲线的建立

将配制好的A-40926 B0标准溶液进行HPLC分析，以A-40926 B0浓度为横坐标、以峰面积为纵坐标绘制A-40926 B0标准曲线，如图1所示。达巴万星前体A-40926 B0浓度X与峰面积Y之间具有良好的线性关系，Y=0.0458X-0.0058，相关系数 R2=0.9993。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 碳源对达巴万星前体A-40926 B0产量的影响

碳源通常通过直接影响微生物的生长、糖代谢及相关代谢影响抗生素的合成与分泌[14]。以初始发酵培养基为基础培养基，固定氮源不变，选取初始浓度为20 g/L的葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糊精、甘油、可溶性淀粉和玉米淀粉作为唯一的碳源。碳源优化结果如图2所示，当葡萄糖作为唯一碳源时A-40926 B0产量最高为483.65 mg/L，而采用葡萄糖15 g/L与麦芽糊精20 g/L组合的初始发酵培养基产量为845.67 mg/L，说明葡萄糖与其他迟效碳源组合有利于A-40926 B0的产生。考察葡萄糖的添加量的影响为（5～50 g/L）结果表明，葡萄糖最适浓度为20 g/L，产量为932.34 mg/L，进一步考察葡萄糖与其他迟效碳源组合的影响，选择葡萄糖20 g/L与麦芽糊精、甘油、玉米淀粉进行组合选取浓度为15、20、25、30和35 g/L，其他成分保持不变，实验结果见图3。葡萄糖与麦芽糊精组合效果最好，麦芽糊精30 g/L时产量最高为1154.56 mg/L。

2.2.2 氮源对达巴万星前体A-40926 B0产量的影响

以初始发酵培养基为基础培养基，固定碳源不变，选取初始浓度为20 g/L的酵母膏、酵母浸粉、玉米浆干粉、棉籽蛋白粉、黄豆饼粉、蛋白胨、酪蛋白胨、花生饼粉、胰蛋白胨、尿素、硫酸铵和硝酸钾作为唯一的氮源。氮源优化结果如图4，黄豆饼粉作为单一氮源时产量最高，但还是低于初始发酵培养基黄豆饼粉20 g/L和酵母浸粉15 g/L的组合，说明黄豆饼粉与其他氮源组合效果更好。考察黄豆饼粉浓度影响，选取的黄豆饼粉添加量为10～60 g/L，结果表明，黄豆饼粉浓度为40 g/L，产量最高为1235.34 mg/L。进一步考察黄豆饼粉与其他氮源组合，选择黄豆饼粉40 g/L与酵母浸粉、鱼蛋白胨、蛋白胨进行组合选取浓度为5、10、15、20和25 g/L，其他成分保持不变，实验结果见图5。黄豆饼粉与酵母浸粉组合效果最好，酵母浸粉15 g/L时产量最高为1452.58 mg/L，但在黄豆饼粉和酵母浸粉组合基础上加鱼蛋白胨10 g/L，组合后产量高达1603.22 mg/L。

2.2.3 无机盐对达巴万星前体A-40926 B0产量的影响

在优化碳氮源的发酵培养基基础上考察无机盐对A-40926 B0产量的影响，以不加无机盐的培养基为对照，取1 g/L的磷酸氢二甲、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、氯化钠、七水硫酸镁、氯化钾、硫酸铜、钼酸钠、氯化锰、硫酸锌作为唯一的无机盐，结果如图6。与对照相比添加硫酸亚铁和七水硫酸镁都能促进A-40926 B0的合成，产量分别为1648.55 mg/L、1635.50 mg/L。分别对硫酸亚铁和七水硫酸镁做了0.5、1、1.5、2、2.5和3g/L最适浓度考察，结果表明，硫酸亚铁1 g/L和七水硫酸镁2 g/L时A-40926 B0产量最高，分别为1643.56和1673.35 mg/L（图7）。

2.2.4 氨基酸对达巴万星前体A-40926 B0产量的影响

在优化无机盐的发酵培养基基础上考察氨基酸对A-40926 B0产量的影响，以不加氨基酸的培养基为对照，选取初始浓度为2 g/L的L-精氨酸、L-赖氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-色氨酸、酪氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-赖氨酸盐酸盐作为唯一的氨基酸，结果如图8。L-缬氨酸对达巴万星前体A-40926 B0合成具有明显促进作用，产量高达1947.00 mg/L。这与Beltrametti等[15]报道的结果一致，L-缬氨酸是A-40926 B0潜在前体，对L-缬氨酸做了1、3、5、7和9g/L最适浓度考察，结果表明，L-缬氨酸在3 g/L时A-40926 B0产量最高为2011.87 mg/L（图9）。

2.2.5 烟酸对达巴万星前体A-40926 B0产量的影响

除氨基酸外其他生长因子是否对A-40926 B0产量产生影响，烟酸在医药领域应用较广，且烟酸用于代谢中合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）。NAD对于糖酵解和柠檬酸循环以及ATP的再生至关重要[16-17]。选用烟酸这一生长因子考察对A-40926 B0产量的影响，通过向培养基中加入0.5、0.75、1.0、1.25和1.5 g/L的烟酸，结果表明烟酸能明显提高A-40926 B0产量，添加量为0.75 g/L时，产量达2115.4 mg/L相较于未添加烟酸产量提高了5.1%。

通过单因素试验优化后的初始培养基配方为葡萄糖20 g/L、麦芽糊精30 g/L、黄豆饼粉40 g/L、酵母浸粉15 g/L、鱼蛋白胨10 g/L、七水硫酸镁2 g/L、硫酸亚铁1 g/L、L-缬氨酸3 g/L、烟酸0.75 g/L、碳酸钙3 g/L。在此培养基基础上进行以下优化实验。

2.3 Plackett-Burman试验设计

Plackett-Burman试验结果见表2，以A-40926 B0产量（Titer，mg/L）作为响应值，对数据进行回归分析得到关于A-40926 B0产量的多元一次回归方程：A-40926 B0产量=2055.98-19.12×A+49.30×B+22.61×C+74.90×D-20.51×E+11.60×F-13.62×G+20.44×H+16.46×J。对表2数据进行方差分析，结果见表3。方差分析表明：因素A、B、C、D、E、H均显著（P<0.05），由F检验表明B、C、D、E是构建模型的主要影响因子。

2.4 最陡爬坡试验结果

根据Plackett-Burman实验结果中麦芽糊精B、黄豆饼粉C和酵母浸粉D为正效应因子（t值为正），鱼蛋白胨E为负效应因子（t值为负）。如表4所示，在试验2条件下，A-40926 B0产量达到最大，这说明在第二组试验条件附近存在最优发酵条件，故以试验2的条件作为响应面试验因素的中心点。

2.5 响应面设计

根据最陡爬坡试验得到中心点：麦芽糊精37.5 g/L、黄豆饼粉47.5 g/L、酵母浸粉20 g/L、鱼蛋白胨6 g/L，应用Design Expert 13软件，采用Box-Behnken方法對菌株DB-3-04产A-40926 B0发酵进行4因子3水平（表5～6）的响应面分析实验。经Design-Expert13软件拟合，各因素对A-40926 B0产量的编码值回归方程如下：A-40926 B0产量=2361.61+8.25×A-51.74×B+25.55×C+7.62×D-13.26×AB+10.89×AC-14.26×AD-19.28×BC-4.89×BD-0.49×CD-36.67×A2-53.38×B2-46.44×C2-50.52×D2。回归方程的校正系数R2为0.9570，说明方程的拟合度良好，可有效预测A40926 B0产量的最优组合。

方差分析结果由表7可知，模型f值为45.50，P<0.0001，失拟项的P值为0.3636，该值不显著，信噪比为19.3494大于4，说明模型显著性极好，具有统计学意义。

采用Design Expert 13.0软件求出当A（麦芽糊精）38.18 g/L、B（黄豆饼粉）46.00 g/L、C（酵母浸粉）21.29 g/L、D（鱼蛋白胨）6.06 g/L时，预测A-40926 B0产量的最大值可以达到2383.98 mg/L。

根据Box-Behnken的实验结果绘制出三维响应面图，如图10所示。

2.6 最佳发酵培养基的验证

经过上述试验得到优化的发酵培养基配方为：葡萄糖20 g/L麦芽糊精38.18 g/L、黄豆饼粉46.00 g/L、酵母浸粉21.29 g/L、鱼蛋白胨6.06 g/L、硫酸亚铁1 g/L、七水硫酸镁2 g/L、L-缬氨酸3 g/L、烟酸0.75 g/L、碳酸钙3 g/L，pH 7.0。优化后A-40926 B0产量为2379.67 mg/L，比响应面优化之前的产量845.67 mg/L提高了281.39%，且与预测值2383.98 mg/L十分接近，证明此响应面模拟参数较为可靠，具有使用价值。

3 讨论与结论

达巴万星结构复杂，目前不能通过化学合成方法制取，只能通过发酵半合成的方式获得，通过发酵得到的前体A-40926 B0的基礎上，经氨基葡萄糖醛酸上的羧基酯化、38位羧基酰胺化、酯水解、成盐得到达巴万星[18]。因此通过发酵工艺优化提高达巴万星前体A-40926 B0产量尤为重要。

近年来，主要以菌种诱变和发酵工艺优化来提高达巴万星发酵水平，陈昌发等[19]利用紫外和亚硝基胍诱变技术，通过摇瓶和发酵罐工艺优化，A-40926 B0产量达到1223 mg/L。王小连等[20]通过UV-ARTP复合诱变，使产量提高了68.7%。梁育松等[21]采用ARTP诱变选育，通过摇瓶工艺优化和发酵罐验证，A-40926 B0产量达到2863.8 mg/L。响应面法是一种多元统计分析方法，通过构建数学模型来优化多个因素之间的关系，可用于优化发酵培养基组成，实验次数少、数据可视化分析、精度高，已经广泛应用于培养基成分的优化[22-25]。本实验采用单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应面设计等方法优化达巴万星前体A-40926 B0发酵培养基，得到最优培养基配方为葡萄糖20 g/L麦芽糊精38.18 g/L、黄豆饼粉46.00 g/L、酵母浸粉21.29 g/L、鱼蛋白胨6.06 g/L、硫酸亚铁1 g/L、七水硫酸镁2 g/L、L-缬氨酸3 g/L、烟酸0.75 g/L、碳酸钙3 g/L，优化后的培养基其A-40926 B0产量较原始培养基提高了281.39%，为后期发酵罐中试和大规模生产提供重要参考。

参 考 文 献

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