不同浓度L-Met 在拟南芥幼苗根系发育中的功能分析

王 雷，刘国兰,2,3

（1. 滨州学院 生物与环境工程学院，山东 滨州 256603; 2. 山东省黄河三角洲生态环境重点实验室，山东 滨州 256603; 3. 山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心，山东 滨州 256603）

根是植物吸收土壤水分和矿质营养的重要器官，为植物体提供机械支撑使其固定在土壤里。根系发育好坏直接影响作物地上部的生长状况，很大程度上决定着作物的产量，因此对根系生长发育的研究具有重要的理论价值和实践意义[1-2]。拟南芥作为双子叶植物，其根系属于直根系，主根发达，发挥着重要的作用，而作为根生命活动最为旺盛的部位-主根根尖，在根生长发育中作用是极其重要的[2-3]。从纵向上来看，拟南芥的根尖从向上依次可划分为根冠、分生区、伸长区和成熟区[2,4]。其中，根冠位于根尖的最顶端内含淀粉粒，可以保护幼嫩的分生区并与根向地性有关。根尖的顶端分生组织（root apical meristem, RAM）也叫根尖生长点，该区域的细胞具有持续分裂产生新的细胞的能力[2,4]。分生区与伸长区之间的区域被称为过渡区，过渡区的细胞分裂速度变慢，细胞变长并向伸长区转化[2,4]。伸长区细胞进行伸长生长，细胞体积变大，最终细胞分化形成成熟区，此区表皮细胞部分发育成根毛，因此又称之为根毛区[3-4]。根分生区从纵切面看，从外到内依次为表皮，皮层，内皮层，中柱鞘和中柱[4-5]。拟南芥根尖的几大区域的组织和细胞都起源于位于根尖的一群具有无限增殖能力而本身保持未分化状态，可以自我更新并能够持续分裂形成新的子细胞－根干细胞[2,7]。根干细胞及中央的是几乎不进行分裂的细胞组成根干细胞静止中心（quiescent Center，QC）[6-8]。

Met 是脊椎动物包括人体的一种必需的含硫氨基酸[2,9-10]，具有多种生理功能，在植物中，Met 也是一种基本的代谢物，在胞内代谢中处于一个核心环节的位置[2,11-12]。前人研究发现，小部分的Met将用来参与蛋白质的合成，大部分的Met 将作为腺苷甲硫氨酸（SAM）的合成前体发挥作用[2,13-14]。Met 作为体内最重要的甲基供体，为DNA、RNA、脂质、蛋白质、生物碱、胆碱、果胶、植物甾醇等甲基化修饰提供甲基[2,13-14]。作为甲基供体，Met 通过SAM 调控细胞分裂、细胞壁合成、叶绿素合成，以及膜的合成等重要生物学过程[2,14]。此外，在高等植物中，Met 也是植物激素乙烯的合成前体物质[15-16]。研究发现，Met 也可为多胺合成过程提供丙胺基，在细胞分裂分化、细胞凋亡、基因表达，以及稳态维持等生物学过程发挥作用[2,15,17]。近年来研究发现，L-Met 亦可作为一种信号分子行使功能，激活位于拟南芥活性氧ROS 形成的上游GLR Ca2+通道来调节气孔运动和植物生长发育[18]。前人利用营养缺陷突变体筛选单倍体烟草原生质体得到了第一个需要Met 的皱叶烟草突变体（10.1/9）[13,19]。此外，土豆反义CBL 转基因植株，Met 含量降低，导致植株表现出发育迟缓矮小，土豆块茎变小，数量降低等产量降低性状[20]。目前发现，外源氨基酸特别是外源Met 对植物根系生长发育的影响鲜有报道，待补充完善。本研究在基础培养基上添加不同浓度梯度的外源L-Met 培养拟南芥幼苗，通过对幼苗主根长度、分生组织长度、皮层细胞数目的统计分析，探究不同浓度L-Met 在拟南芥根生长发育中的的功能。本研究结果有益获得利于根系生长的最佳外源甲硫氨酸添加浓度，这将为促进植物生长，作物增产增收提供重要的理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 植物材料 本研究中拟南芥材料均为拟南芥哥伦比亚型种子Columbia（Col-0）。

1.1.2 主要仪器与试剂 本研究用到的仪器包括高压灭菌锅（北京发恩科贸D-1），纯水机（北京普析GWB-2T），电热恒温培养箱（上海一恒DHP-9082)，试验电炉（天津市泰斯特仪器DK-98-Ⅱ），电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒），移液器（2.5 μL，10 μL，20 μL，200 μL，1mL（Thermo Scientific）），电子天平（北京艾科勒ALC-210.3），DIC 和荧光显微镜（OLYMPUS BX51），解剖镜（NIKON SMZ1000）。双人单面净化工作台（SW-CJ-2D，苏州净化设备有限公司），pH 计（SARTORIOUS PB-10），智能光照培养箱（上海一恒）。

本研究用到的试剂包括1/2MS 培养基（Phyto Technology Laboratories 公司，M5519），琼脂（广东环凯微生物科技有限公司），蔗糖（上海生工生物工程有限公司），氢氧化钠（天津市福晨化学试剂厂），LMet（Sigma），阿拉伯树胶（Sigma），水合三氯乙醛（Sigma），甘油（Sigma）。

1.2 试验方法

1.2.1 植物MS 培养基的配制 1/2MS 固体培养基：每700 mL 超纯水加入4.48 g MS 培养基干粉，8 g 琼脂Agar，15 g 蔗糖，定容到1 000 mL。1 mol·L-1NaOH 调节pH 至5.6～5.8，121 ℃，高压灭菌20 min。

灭菌结束后，超净工作台倒平板，对照组采用1/2MS 培养基直接倒平板，500 mL 可倒20 个平板。含不同L-Met 浓度梯度1/2MS 培养基：L-Met 配制成0.3 mg·mL-1的母液，0.2 μm 过滤膜过滤除菌分装-20 ℃保存备用；分别向冷却至60 ℃的1/2MS 固体培养基中加入配制好的不同体积L-Met 母液，配制成含L-Met 浓度分别为0 μmol·L-1（A）、30 μmol·L-1（B）、60 μmol·L-1（C）、120 μmol·L-1（D）的梯度浓度培养基。

1.2.2 拟南芥无菌苗的培养及外源L-Met 添加试验 种子表面消毒及播种：拟南芥哥伦比亚型种子（col-0）70%乙醇依次消毒3 次，每次消毒1 min；用50%次氯酸钠溶液（含去污剂）消毒1 次，5 min；转移至超净工作台，无菌水清洗3 次至溶液变清；将种子上下颠倒混匀后倾倒在灭菌滤纸上；随后用无菌牙签将种子点播在含不同浓度L-Met 的1/2 MS培养基平板上，15 粒均匀排成一行，封口膜封口后置于4 ℃冰箱冷暗处理48 h。

将平皿垂直放入光照培养箱培养，并保持一定的间距（以便有充分的光照）。光照培养条件：温度（22±1）℃，湿度70%，16 h 光照/8 h 黑暗，16 000 lx光照强度。

1.2.3 幼苗表型分析 根长分析：拟南芥幼苗在1/2 MS 固体培养基上垂直培养7 d，高清像素相机拍照后用Image J 软件（http://rsbweb.nih.gov/ij/），测量幼苗的主根长度，每次测量30～50 株。

幼苗根分生组织分析：分生组织的大小主要由从根尖静止中心至伸长区之前的皮层细胞数目决定，取萌发7 d 的拟南芥幼苗加透明液（7.5 g 阿拉伯树胶，100 g 水合三氯乙醛，5 mL 甘油，60 mL 水，室温搅拌混匀3～5 h 或过夜）制片，于显微镜（20x 物镜）下对根分生组织进行拍照（n＞30）观察。

1.3 数据分析

用Excel 对数据进行统计分析，用SPSS 进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 L-Met 参与拟南芥主根的伸长生长

生长在不含有L-Met 的1/2 MS 培养基上的垂直培养的拟南芥WT 幼苗主根生长状态良好，生长速度较快（图1-A）。当L-Met 的处理浓度为30μmol·L-1时，WT 幼苗根系生长程较发达状态（图1-B），侧根增多，主根长度与对照差异不大，或稍长。但随着L-Met的处理浓度不断提高，L-Met 的处理浓度为60 μmol·L-1时，WT 幼苗根系生长受到抑制（图1-C），主根长度明显变短，约为对照处理的三分之一长度，除此之外，地上部分的生长也稍受抑制。L-Met 的处理浓度为120 μmol·L-1时，主根生长抑制程度更显著（图1-D）。

图1 不同浓度L-Met 处理下的拟南芥根系生长状况

2.2 梯度浓度L-Met 处理下拟南芥主根长度统计

通过使用Image J 软件对生长在不同浓度梯度（0、30、60、120 μmol·L-1L-Met）培养基上的拟南芥7 d苗龄WT 幼苗主根进行长度测量（统计样本数平均大于20）, 数据统计分析发现生长在不含有L-Met培养基上幼苗主根平均长度为（33.4±0.9）mm（图2）。当L-Met 的处理浓度增大为30 μmol·L-1时，主根增大0.9 mm，平均长度为（34.3±1.2）mm（图2）。与对照处理相比较，统计分析，差异未达到显著水平（P=0.058）。但随着L-Met 的处理浓度不断提高，LMet 的处理浓度为60 μmol·L-1时，根系生长受到抑制，主根长度明显变短，统计数据显示平均长度为（12.0±0.4）mm，与对照处理相比较，差异极显著（P＜0.01）（图2）。当L-Met 的处理浓度增大至120 μmol·L-1时，主根生长抑制作用更加显著，平均长度为（10.0±0.7）mm，与对照处理相比较，差异极显著（P＜0.01）（图2）。

图2 梯度浓度L-Met 处理下拟南芥主根长度

2.3 L-Met 处理后拟南芥根尖分生组织的变化

通过对根尖进行透明处理，显微镜拍照得到不同梯度浓度L-Met 处理下的根尖分生组织照片。图3-A 为无添加L-met 处理下WT 的根尖分生组织，白色竖线标记的为根分生组织区域，是指从根尖静止中心到过渡区的皮层细胞的区段。图3-B 为30 μmol·L-1L-Met 处理下WT 的根尖分生组织照片，处于不断分裂状态的皮层细胞及根尖干细胞分裂活动比较旺盛。图3-C 为60 μmol·L-1L-Met 处理下WT 的根尖分生组织的长度状态，与对照相比较，根尖出现分化，分裂细胞减少。图3-D 为120 μmol·L-1L-Met 处理下WT 的根尖分生组织的长度状态，随L-Met 浓度的增大，根尖分化程度愈趋严重，分裂细胞锐减。

图3 梯度浓度L-Met 处理下拟南芥主根根尖分生组织

2.4 L-Met 处理后拟南芥根尖分生组织长度及皮层细胞数的统计

通过对生长在不同浓度梯度L-Met 培养基上的拟南芥WT 幼苗主根进行根尖分生组织长度进行测量，数据统计分析发现生长在不含有L-Met 的普通培养基上幼苗根尖分生组织平均长度为（243.0±9.1）μm。当L-Met 的处理浓度增大至30 μmol·L-1时，根尖分生组织变长，平均长度增至（254.2±5.6）μm，但与对照相比差异不显著。随L-Met 的处理浓度提高，L-Met 的处理浓度为60 μmol·L-1时，根尖分生组织变短，平均长度为（165.4±10.9）μm，与对照处理相比较，差异极显著（P＜0.01）。当L-Met 的处理浓度增大至120 μmol·L-1时，分生组织继续分化，平均长度为（122.1±13.6）μm，与对照处理相比较，差异极显著（P＜0.01）（图4-A）。

笔者同时对所统计的根尖分生组织区域所对应的皮层细胞数目进行统计，图4-B 中所示，不含有L-Met 的普通培养基上幼苗根尖皮层细胞约（36.0±1.5）个；30 μmol·L-1浓度处理下，皮层细胞数增加，平均增至为（38.0±0.9）个；60 μmol·L-1浓度处理下，皮层细胞数锐减，平均降为（23.0±2.1）个，与对照处理相比较，差异极显著（P＜0.01）；浓度增加至120 μmol·L-1时，皮层细胞数继续降低，平均降为（18.0±2.0）个，与对照处理相比较，差异极显著（P＜0.01）。

图4 梯度浓度L-Met 处理下拟南芥根尖分生组织长度及皮层细胞数目

通过梯度浓度的L-Met 对拟南芥幼苗进行处理，拟南芥根尖分生组织长度及皮层细胞数都呈现同时增加或降低的相同趋势。这说明L-Met 对拟南芥幼苗根生长发育的影响不是通过调节细胞大小体积实现的，而是通过调剂具有分裂能力的细胞数目的多少影响根的长度。L-Met 通过抑制根尖分生组织的分裂活性进而抑制主根生长。

3 讨论与结论

本试验主要是从研究甲硫氨酸对于植物根系生长发育的影响出发，在基础培养基中添加梯度浓度的L-Met（0、30、60、120 μmol·L-1），光下培养7 d 后进行观察统计分析。我们分别测定了主根长度，根尖分生组织长度以及皮层细胞数目等指标，试验结果显示，低浓度（30 μmol·L-1）的L-Met 可以促进拟南芥根系生长，主根变长，侧根数目目测增多，但未达到差异显著水平。与此同时，随着L-Met 浓度的增加，其对根系生长的促进作用并不是梯度增强的。相反，L-Met 浓度越高，表现出对根系生长的抑制作用越强，即浓度大于60 μmol·L-1时，拟南芥主根生长明显受抑制，根尖分生区细胞逐步分化，皮层细胞数目减少，进而导致根尖分生组织变短，且差异极显著。继续增大L-Met 浓度至120 μmol·L-1时，根尖分生区细胞分化愈发严重，L-Met 通过抑制根尖分生组织细胞分裂活性进而导致主根生长缓慢，根生长受抑制效应也更加明显，统计分析差异极显著。由此可以推断，当L-Met 浓度增大至一定范围，植物将不能正常萌发生长，甚至死亡。本研究还发现，LMet 浓度范围在0～30 μmol·L-1范围，是可以促进植物根系的生长发育的，因此可以寻找一个最佳LMet 浓度添加到培养基或其他培养介质中，为促进植物生长，作物增产增收提供新的思路。

本研究发现，L-Met 浓度范围在0～30 μmol·L-1范围附近，可以促进植物根系的生长发育，但促进根系生长的L-Met 最适宜浓度还有待验证。拟南芥根尖在L-Met 浓度在增大至60 μmol·L-1会抑制根系生长，那么具体添加多少L-Met 浓度对促进拟南芥的生长效应最高，从多少L-Met 浓度开始对拟南芥的根系发育出现抑制还需要进一步探索。