贝莱斯芽孢杆菌JK-1 可湿性粉剂研制及对辣椒褐腐病的防治效果

赵春燕，安良聪，赵秋玲，孙中涛

（1.聊城市茌平区农业农村局，山东 茌平 252100；2.山东农业大学生命科学学院，山东 泰安 271000；3.聊城市茌平区信发集团，山东 茌平 252100）

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）是一种常见的生防细菌，能够有效抑制多种植物病原菌生长[1]。贝莱斯芽孢杆菌通过代谢为植物生长提供N、P、K 和Fe 等矿质营养元素，合成生长激素促进植物生长[2]。贝莱斯芽孢杆菌能诱导植物产生系统抗病性[3]，与病原菌共存时彼此产生竞争作用[4]，达到抑菌和防病的效果[5]。肖倩等[6]分离的贝莱斯芽孢杆菌HMQAU19044 对黄瓜霜霉病的防效高达59.82%，有很好的治疗作用，并且持效期长；迟惠荣等[7]分离得到的贝莱斯芽胞杆菌ZJU-3 发酵液中，脂肽粗提物可明显抑制尖孢镰刀菌菌丝的生长，抑制率达到51.6%，同时该菌株对多花黄精具有显著促生效果；长江大学植物与微生物互作研究室分离得到的贝莱斯芽孢杆菌D61-A 对水稻纹枯病具有很好的抑制效果[8]。目前国内外已有部分贝莱斯芽孢杆菌被制作成微生物菌肥或生物杀菌剂，用于多种植物病害的防治[9]，贝莱斯芽孢杆菌TK2019 微生物菌剂田间试验证实，对棉花黄萎病的防效高达92.69%[10]；贝莱斯芽孢杆菌BV03 菌剂在工厂化育苗中促生效果达到30%,能使壮苗指数提升45%以上[11]。由此可见贝莱斯芽孢杆菌的应用前景广阔。

本试验中的贝莱斯芽孢杆菌JK-1 是在辣椒根际土壤中筛选得到的，前期试验证明JK-1 菌株抗菌谱广。为了进一步挖掘贝莱斯芽孢杆菌JK-1 的生防潜力，广泛开展实际应用，本文开展了该菌剂的研究，并以辣椒褐腐病为例，测定了其对病害的防治效果，筛选出适合制造该菌可湿性粉剂的理想助剂，以期能为该菌株的商品化开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌种 贝莱斯芽孢杆菌JK-1，辣椒褐腐病病原菌角担菌（Ceratobasidium ramicola）BING-15，由山东农业大学生命科学学院实验室提供。

1.1.2 供试菌粉制备及病原菌活化 玉米秸秆75%，麸皮25%、玉米2.60%、硫酸铵1.48%、硫酸锰0.10%、接种量8%、pH 值7.03，在37 ℃培养箱固态发酵48 h在45 ℃烘箱烘干后，进行超微粉碎，制成菌粉。活菌数最高达到620.00 亿·g-1、芽孢生成率最高为85%。

病原菌活化：将病原菌BING-15 菌种接种到新的PDA 培养基上，28 ℃的恒温培养箱内培养72 h。

1.1.3 供试试剂 载体：硅藻土、高岭土、白炭黑、凹凸棒土；湿润剂：十二烷基硫酸钠（SDS）、聚乙二醇（PEG2000）、CaCl2；分散剂：木质磺酸钠、三聚磷酸钠、亚甲基二磺酸钠（NNO）、阿拉伯树胶、羧甲基纤维素钠；保护剂：腐殖酸钠、黄原胶、高岭土、糊精、可溶性淀粉。

1.1.4 室内盆栽试验材料 线辣椒幼苗，品种为：‘帝王336’，潍坊寿光鑫青种苗公司提供。供试土壤：济南市佐田氏生物有限公司试验田土壤。栽培花盆规格：上内径20 cm、下内径14 cm、高16 cm。

1.2 相关指标的测定方法

1.2.1 生物相容性（活菌数）的测定 将样品稀释制成发酵液，按照不同梯度在LB 平板上涂布，计算每个平板的菌落数，最终换算出活菌数。

1.2.2 润湿时间的测定 按《农药湿性粉剂之间温性剂定方法》（GB/T5451—2001）[12]为参考标准测定润湿时间。

1.2.3 悬浮率的测定 按国家标准《农药县浮率测定方法》（GB/T14825—2006）[13]为参考标准测定悬浮率。1.2.4 pH 值的测定 按国家标准《农药pH 值的测定方法》（GB/T1601—1993）[14]为参考标准测定pH 值。

1.2.5 细度的测定 参考国家标准《农药粘剂、可湿性粉剂细度测定方法》（GB/T 16150—1995）[15]农药可湿性粉剂细度测定。

1.3 载体的筛选

母粉的制备：将菌粉分别与4 种载体（硅藻土、高岭土、凹凸棒土、白炭黑）按3∶2 例混合均匀，超微粉碎后过筛（200 目）备用，每种样品设置3 组重复，测活菌数、润湿时间、悬浮率值。

1.4 润湿剂的筛选

将各分湿润剂和母粉按1∶5 比例混合均匀后超微粉碎，过筛（200 目）处理备用，每种样品设置3 组重复，测活菌数、润湿时间、悬浮率值。

1.5 分散剂的筛选

将各分散剂与母粉按1∶4 比例混合均匀超微粉碎后过筛（200 目）处理，制得样品，每种样品设置3组重复，测活菌数、润湿时间、悬浮率值。

1.6 保护剂的筛选

将各保护剂与母粉按1∶50 比例混合均匀超微粉碎后，过筛（200 目）处理，每种样品设置3 次重复，各组处理在距离紫外灯（254 nm，20 W）40 cm 处照射40 min。将样品稀释后涂布，观察菌落生长效果，以不添加保护剂、紫外不处理为对照，通过比较紫外线照射前后可湿性粉剂理化性质筛选紫外保护剂。

载体、润湿剂、分散剂、保护剂筛选中活菌数、润湿时间、悬浮率的测定按照1.2.1 中的国家标准和方法进行测定。

1.7 可湿性粉剂配方的研制

将筛选的最佳载体、分散剂、润湿剂和保护剂设置成四因素三水平L9（34）（表1）的设计进行正交试验，将各种助剂按照比例混合均匀制成可湿性粉剂，通过测定悬浮率确定可湿性粉剂的最佳配方。

表1 助剂筛选的因素和水平

1.8 可湿性粉剂质量指标的测定

根据最佳配方研制的可湿性粉剂，按照1.2.1 中的国家标准和方法测定活菌数、润湿时间、悬浮率、pH 值、细度。

1.9 贝莱斯芽孢杆菌JK-1 可湿性粉剂效果研究

1.9.1 离体果实防治效果 选取长势一致的辣椒果实，用75%的酒精消毒后，再用无菌水冲洗3 次擦干备用。将辣椒果实浸泡在可湿性粉剂稀释液（250倍）2 h 后取出，将活化的病原菌BING-15 打菌饼（5 mm），接种到辣椒上（用灭菌的接种针刺伤），接种的辣椒放置到铺满吸水纸的培养皿中，在28 ℃培养箱培养3 d，测量辣椒果实的病斑长度，根据公式计算防治效果。以无菌水浸泡为对照。每组处理设3 个重复，每个重复处理5 个辣椒。

防治效果=（对照组病斑长度径-试验组病斑长度径）/对照组病斑直径×100%。

1.9.2 盆栽试验 盆栽试验设置了3 组分别为CK、T1 和T2，每1 组设置了5 盆，每盆装土2.5 kg，定植一株长势大致一致的线辣椒幼苗。在辣椒开花期，分别从每组处理中选取3 盆长势一致的辣椒植株进行试验。活化的病原菌菌饼接种在PDA 液体培养基中培养72 h 后，制成发酵液。设2 个处理：T1为施加500 mL 病原菌发酵液+500 mL 无菌水；T2为500 mL 病原菌发酵液+500 mL 可湿性粉剂稀释液（250 倍）500 mL；以1 000 mL 无菌水为对照。浇灌辣椒根际土壤，25 d 后通过松土处理，将辣椒植株地上与根系部位完整取出，用清水将根部泥土清洗干净，并用吸水纸擦拭干净。本试验将辣椒植株的株高、茎粗、鲜质量、干质量作为生物量的测定指标。辣椒的株高茎粗通过米尺和游标卡尺测量；辣椒的鲜质量采用直接称质量法测量；辣椒干质量采用烘干测量法测定。

1.10 数据处理

采用Microsoft Excel 2013 软件进行数据处理，利用SPSS 22.0 软件进行数据统计分析，采用正交试验进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 载体的筛选

通过表2 可知，以凹凸棒土和高岭土为载体的样本活菌数较高，分别522.00 亿·g-1和576.00 亿·g-1，两者差距不大。硅藻土和高岭土润湿时间和悬浮率分别为47.67s、50%和82.77s、78%。润湿性是农药可湿性粉剂的一个重要性能指标，悬浮率高，菌剂能均匀悬浮在水中，在喷头中均匀喷出，达到好的防治效果。同时，也要考虑到制剂的实用性，选择成本低、原材料丰富、运输便利的载体。综合考虑，选择高岭土为最佳载体。

表2 载体的筛选

2.2 润湿剂的筛选

由表3 可知，以聚乙二醇为湿润剂的样本活菌数为600.00 亿·g-1，最高，SDS 和聚乙二醇悬浮率较高，分别为75%、77%，润湿时间聚乙二醇润湿时间最少50 s；润湿剂能够降低水的表面张力，有利于有效成分尽快被水润湿，更好发挥可湿性粉剂的药效。因此，筛选润湿剂时中应着重考虑其悬浮率和润湿性。综合考虑，选择聚乙二醇为最佳润湿剂。

表3 润湿剂的筛选

2.3 分散剂的筛选

由表4 可知，以羧甲基纤维素钠为分散剂的样本活菌数、悬浮率最高分别为576.00 亿·g-1、78.27%，润湿时间为亚甲基二磺酸钠夫＞对照＞阿拉伯树胶＞羧甲基纤维素钠＞木质磺酸钠＞三聚磷酸钠。分散剂可以降低菌粉表面张力,使其在介质中均匀分散，有利于可湿性粉剂发挥稳定性能。羧甲基纤维素钠的活菌数高、悬浮率高，润湿效果较优，成本相对较低.综合考虑,选择羧甲基纤维素钠为最佳分散剂。

表4 分散剂的筛选

2.4 保护剂的筛选

由表5 可知，经紫外线照射后，保护剂为可溶性淀粉时，菌剂的活菌数最高，为557.00 亿·g-1；黄原胶和可溶性淀粉为保护剂是，菌剂悬浮率最高，为79.67%。在筛选保护剂的过程中，活菌数是重要的衡量指标。综合考虑，选择可溶性淀粉为最佳保护剂。

表5 保护剂的筛选

2.5 可湿性粉剂配方的筛选

通过单因素试验确定高岭土、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠和可溶性淀粉为可湿性粉剂的最佳载体和助剂。以这4 种材料为筛选因素进行正交试验，设置3 个质量分数。将悬浮率作为指标，由表6极差分析可知，极差分析可知4 个因素结合R 值（因素极差值）对比可知4 个因素优劣排序为：R3＞R2＞R4＞R1；4 个影响因素按影响程度依次为: C 羧甲基纤维素钠＞B 聚乙二醇＞D 可溶性淀粉＞A 高岭土。因此，可湿性粉剂的最佳方案A2B3C2D3，即高岭土35%、聚乙二醇8%、羧甲基纤维素钠12%和可溶性淀粉0.8%。

表6 助剂正交试验结果

2.6 可湿性粉剂质量指标测定

如表7 可知，根据JK-1 菌株可湿性粉剂的筛选试验确定最优组分为高岭土35%、聚乙二醇8%、羧甲基纤维素钠12%和可溶性淀粉0.8%，菌粉补足至100%制成可湿性粉。此工艺制成可湿性粉剂测得活菌数为580.00 亿·g-1、悬浮率为86.00%、润湿时间为89 s、pH 值为7.06、细度为94.16%。因此可知，各项指标均符合农药可湿性粉剂的国家标准，说明制成的可湿性粉剂合格。

表7 可湿性粉剂指标的测定

2.7 贝莱斯芽孢杆菌JK-1 可是湿性粉剂效果

2.7.1 离体果实防治效果 将辣椒褐腐病病原菌接种到辣椒果实上，结果发现经JK-1 可湿性粉剂稀释液浸泡之后，果实发病程度明显小于清水处理组（图1）。清水处理的果实腐烂程度严重，腐烂面积大，腐烂病斑长度达到6.38 cm；稀释液处理的果实，腐烂程度明显受到抑制，腐烂病斑长度为2.27 cm（表8）。通过计算得知，JK-1 菌株能够防治辣椒褐腐病，防治效果为64.4%。

图1 JK-1 可湿性粉剂处理后辣椒褐腐病对辣椒果实的侵染状况

表8 JK-1 可湿性粉剂对辣椒果实的防治效果

2.7.2 可湿性粉剂对辣椒的促生作用 可湿性粉剂对辣椒的生长的促进作用如9 表所示。与对照组相比，T2 处理组长势良好，无褐腐病病害发生，株高、茎粗、鲜质量、干质量、根长均增加，分别增加了32.65%、17.39% 、1.17%、7.78%、14.10%；T1 处理的株高、茎粗、鲜质量、干质量、根长均下降，说明辣椒褐腐病病原菌能够抑制辣椒生长，施加JK-1 可湿性粉剂不仅能够有效防治辣椒褐腐病，对辣椒生长也有一定促进作用。

表9 可湿性粉剂对辣椒生长的影响

3 讨论与结论

微生物制剂中的可湿性粉剂是最主要的类型，可湿性粉剂比液体菌剂运输和贮藏方便，比其他固体菌剂有效成分多，润湿性和悬浮效果好，农业应用更为广泛。常常用润湿性、与生物相容性、含水量、悬浮率、细度等对可湿性粉剂的性能进行评价[16]。庄新亚等[17]在研制防除野燕麦的可湿性粉剂时发现硅藻土作为载体，润湿性较好，悬浮率较高。李姝江等[18]研制防治核桃根腐病的可湿性菌剂时认为高岭土作为载体，可湿性粉剂的悬浮率较高。本研究认为，高岭土和凹凸棒土与菌株的生物相容性较高，但凹凸棒土悬浮率低，因此选择高岭土为最佳载体。可湿性粉剂在田间防治过程中，紫外线的照射将会影响粉剂内菌体的生长，在制备过程中需要添加可溶性淀粉作为紫外线保护剂，对菌体进行保护。

载体和助剂与可湿性粉剂的悬浮率、润湿时间等各项性能指标有密切关系。李磊等[19]在研制解淀粉芽胞杆菌Ht-q6 可湿性粉剂时选用硅藻土作为载体、分散剂为木质素磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠为润湿剂、保护剂为抗坏血酸，此时润湿时间为45 s、悬浮率为85.6%。本试验研制的可湿性粉剂的配方为高岭土、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠和可溶性淀粉，制成的可湿性粉剂活菌数580.00 亿·g-1、悬浮率86%、润湿时间为89 s，主要指标均性能优于农药可湿性粉剂的国家标准[20]，与李磊等[19]研究结果比较接近。但是润湿时间增加一半，可能是载体和助剂的细度不一样导致。通过辣椒果实离体试验和盆栽试验证实，贝莱斯芽孢杆菌JK-1 可湿性粉剂能减轻辣椒褐腐病的发生，防治效果为64.40%，同时能促进辣椒植株的生长，株高增加32.65%、茎粗增加17.39%、根长增加14.10%。相关研究表明，贝莱斯芽孢杆菌能产生IAA 和铁离子载体，促进植物生长[21]。因此，贝莱斯芽孢杆菌制成的可湿性粉剂既可作为杀菌剂也可作为微生物菌肥使用。