4种狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒的评价

高 露，刘婷芳，蔡冬冬，李盛琼，尹 杰，杨天俊，张 亮，黄雅琳，袁东波，阳爱国，侯 巍

（1.四川省动物疫病预防控制中心，四川成都 610041；2.军事医学研究院军事兽医研究所，吉林长春 130122；3.富顺县农业农村局，四川富顺 643200）

狂犬病（rabies）是由狂犬病病毒（rabies virus，RV）感染引起的人兽共患烈性传染病，临床表现为特异性恐风、恐水以及咽肌痉挛、进行性瘫痪等，病死率高达100%，给公众生命健康带来严重威胁。我国报告的狂犬病发病数仅次于印度，居世界第二位[1]。分析我国狂犬病患者发现，经犬咬伤感染的达90%以上[2]。狂犬病目前尚无有效治疗手段，疫苗免疫是预防该病的唯一途径[3]，因此对犬进行疫苗免疫能有效筑牢狂犬病防控的第一道防线。

世界动物卫生组织（WOAH）和世界卫生组织（WHO）推荐，当血清中RV中和抗体效价大于0.50 IU/mL时，疫苗免疫才视为成功，能够产生免疫保护效力。目前，WOAH和WHO均推荐的狂犬病血清学检测方法只有两种，分别是荧光抗体病毒中和试验（fluorescent antibody virus neutralization test，FAVN）和快速荧光灶抑制试验（rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT）。这两种方法均能检测血清样品中的RV中和抗体效价，可有效评估疫苗免疫效力，但均需高度可控的环境用于细胞培养和病毒复制，且需耗时48 h[4]。因此，需要更快速、常规的技术替代这些试验。酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）目前在很多感染性疾病的血清学诊断中应用较广泛，其操作简便，也不需要生物安全高级别实验室[5]。此外，ELISA对野外收集的因溶血有细胞毒性，对血清中和试验结果有影响的样品同样有效[6]。根据WOAH《陆生动物诊断试验与疫苗手册》，ELISA 是评估免疫效果的最佳方法之一。目前国内常用商品化ELISA试剂盒检测犬RV疫苗免疫后抗体，国外也有经WOAH评估后推荐的ELISA试剂盒，用于犬猫免疫后血清学检测。为了解国产ELISA抗体检测试剂盒的性能，本研究选择了4种国产试剂盒，分别检测463例犬血清样本，以血清学检测方法金标准FAVN为对照，分析比较这几种试剂盒的诊断敏感性、诊断特异性、符合率等，以期为犬RV疫苗免疫效力评价时选用更好的试剂盒提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血清 犬血清共计463份，来自军事医学研究院军事兽医研究所。样品已通过FAVN检测RV中和抗体效价，根据不同抗体效价范围分为5组（表1）。从5组血清中，每组随机选择2份，共10份血清，用于重复性试验。

表1 不同中和抗体效价范围的血清分组

1.1.2 ELISA抗体检测试剂盒 从四川省多地动物疫病预防控制机构常用的RV ELISA抗体检测试剂盒中，选择4种国产品牌试剂盒进行评估，分别编号为A试剂盒（批号202110003A）、B试剂盒（批号RV20211008E）、C试剂盒（批号20210708）和D试剂盒（批号20210817）。

1.1.3 主要仪器设备 酶标仪：日本BIO-RAD公司产品，型号iMarkTM；电热恒温鼓风干燥箱：上海齐欣科学仪器有限公司产品，型号DGX-9243B；移液器：德国Brand公司产品，型号Transferpette-S。

1.2 方法

1.2.1 ELISA抗体检测 用4种ELISA抗体检测试剂盒检测463份样品（阴性163份、阳性300份），严格按照试剂盒说明书进行试验以及结果判定。

1.2.2 性能指标测定 利用四格表法（表2）统计比较不同品牌试剂盒和FAVN的检测结果，用SPSS等软件进行数据分析，通过Kappa检验和配对卡方检验（McNemar检验），评估ELISA与FAVN检测的一致性和差异性，并计算ELISA试剂盒的诊断敏感性、诊断特异性和符合率。Kappa检验评定标准：Kappa系数＜0，一致性程度极差；0～0.20，微弱；0.21～0.40，弱；0.41～0.60，中度；0.61～0.80，显著（或高度一致）；0.81～1.00，极佳。McNemar检验评定标准：P＜0.05为差异显著，P＞0.05差异不显著。诊断敏感性、诊断特异性和符合率分别按公式计算。

1.2.3 重复性测定 对用于重复性试验的10份血清，分别用4种ELISA抗体检测试剂盒检测。每种试剂盒批内重复性试验选择1个板检测，批间重复性试验选择3个板检测。每份血清每个板重复3孔。计算每种试剂盒的批内变异系数和批间变异系数，评估试剂盒的重复性。

1.2.4 试剂盒参数比较 对4种试剂盒的使用范围、样品稀释倍数、孵育与显色时间、判定标准等参数进行比较，考察试剂盒的可操作性。

2 结果与分析

2.1 一致性检验与差异性分析

使用4种ELISA试剂盒检测463份血清，与FAVN比较结果见表3。

表3 4种ELISA试剂盒与FAVN检测结果四格表统计 单位：份

4种ELISA试剂盒的一致性检验与差异性分析结果（表4）显示：4种试剂盒Kappa系数处于0.21～0.40范围内。根据Kappa检验评定标准，判定4种试剂盒与FAVN一致性程度均为弱。McNemar检验A和B试剂盒的P值大于0.05，与FAVN结果的差异不显著；C和D试剂盒P值小于0.05，差异显著。可见A、B试剂盒与FAVN的差异性小于C、D试剂盒。

表4 4种ELISA试剂盒的一致性检验与差异性分析结果

2.2 检测性能指标

计算得到的4种试剂盒诊断敏感性、诊断特异性和符合率数据见表5。在诊断敏感性方面，D试剂盒更好，为96.3%，其他3种试剂盒差异较小，诊断敏感性排序为D＞C＞A＞B。诊断特异性方面，各试剂盒诊断特异性普遍不高，为29.5%～57.7%，其中B试剂盒最高，各试剂盒诊断特异性排序为B＞A＞C＞D。4种试剂盒符合率相当，为71.3%～72.8%，符合率排序为D＞C＞A/B。

表5 4种ELISA试剂盒检测结果比较 单位：%

2.3 重复性试验

从表6可知：批内变异系数均值，A试剂盒最小，B试剂盒均值大于5%，10个样品批内变异系数均值排序为A＜C＜D＜B；批间变异系数均值，C试剂盒最小，A、B、D试剂盒均大于10%，其中B试剂盒大于20%，说明这些试剂盒批间稳定性普遍较差，批间变异系数均值排序为C＜A＜D＜B。因变异系数越小，重复性越好，可见A、C试剂盒的重复性好于D试剂盒，而B试剂盒效果最不理想。

表6 试剂盒批内和批间变异系数 单位：%

2.4 不同中和抗体效价范围血清符合率

从每组中和抗体效价范围血清检测的符合率（表7）可知：第2组（0.10≤X＜0.50）符合率最低，第3组（0.50≤X＜1.00）稍高，这两组FAVN效价均处于0.50 IU/mL这一临界值附近；其他组中，除第1组（X＜0.10）D试剂盒出现低符合率（29%）外，符合率普遍较高。

表7 4种试剂盒检测不同中和抗体效价范围血清的符合率 单位：%

2.5 试剂盒参数比较

将4种国产试剂盒的使用范围、样品稀释倍数、孵育与显色时间等参数进行比较。结果（表8）显示：4种试剂盒均为间接法，其中C试剂盒样品稀释度低，需要量多，可有助于提高灵敏度；D试剂盒虽然孵育时间较长，但其可定性或定量检测，判定标准分为阳性、弱阳、阴性3个等级，结果判定方式较精确。

表8 试剂盒参数比较结果

3 讨论

四川省是我国狂犬病高发省份之一，做好狂犬病的预防尤为重要。为犬注射疫苗是预防狂犬病的有效策略，因为疫苗产生的抗体能有力抵抗RV。免疫后抗体监测有助于评估疫苗免疫效力，也可用于分析抗体消长规律，为制定疫苗免疫程序提供辅助。商品化ELISA试剂盒操作简便、快速，适用于在基层开展抗体监测。目前国内有报道[7-9]将狂犬病ELISA试剂盒与FAVN检测方法进行比对，发现两者符合率较高，但是比对样品数量偏少。本试验扩大了样品数量，用463份已知RV抗体效价的犬血清科学评估了4种国产狂犬病ELISA试剂盒性能参数，为试验提供了有力的数据支持。

通过试验结果可知，试剂盒诊断敏感性为78.7%～96.3%，诊断特异性较低，为29.5%～57.7%。罗静霞等[10]将间接ELISA法与RFFIT比较检测人群RV免疫抗体，发现两者阳性符合率为85.30%，阴性符合率为52.94%，与本试验敏感性和特异性的结果接近。诊断敏感性越高的试剂盒，易出现假阳性，诊断特异性趋于更低，如试验中的D试剂盒诊断敏感性最高，诊断特异性最低，但总体符合率4种试剂盒差别不大，为71.3%～72.8%。国外有研究[5]发现ELISA试剂盒测试多血清样本与FAVN的符合率为86.2%，提示国产试剂盒检测技术仍有提升空间。本试验中的D试剂盒虽然敏感性更高，但检测低中和抗体效价血清（＜0.10 IU/mL）符合率低，特异性差，容易将阴性样品判定为阳性，不利于免疫后抗体监测；B试剂盒敏感性和稳定性均不理想；C试剂盒敏感性次于D试剂盒，但特异性较好，且重复性表现更好，因此认为C试剂盒更能满足免疫后抗体检测需求；A试剂盒敏感性较好，特异性、重复性和差异性也表现不错，因此也可作为临床选用的候选试剂盒。

相比金标准检测方法FAVN，国产狂犬病 ELISA抗体检测试剂盒符合率不够高，特异性低，假阳性高。一些制约因素可能影响了狂犬病ELISA试剂盒检测的准确性，如包被抗原质量、非中和抗体结合物干扰等。FAVN方法采用固定病毒稀释待检血清的办法，将固定浓度的病毒和不同稀释度的待检血清中和，经细胞培养、荧光染色等步骤后判定结果，检测的是血清中和抗体，而间接ELISA检测的是与包被抗原结合的“结合抗体”，有些“结合抗体”不一定是中和抗体[11]，这可能会增加ELISA结果的假阳性率。其次是方法的转换问题，有研究[12-13]建议将FAVN标准从0.50 IU/mL这一临界值调低至0.24 IU/mL，即试剂盒在表6中第2组测出的部分阳性可认为是FAVN阳性，因此金标准临界值一定范围的摆动，可造成在临界值附近ELISA与FAVN符合率不高的问题。此外，由于RV基因组序列比较保守，各国流行毒株的G蛋白差异不大，国内外间接ELISA试剂盒多采用RV G蛋白包被酶标板，但国内部分产品使用片段未知的重组RV重组抗原，造成包被抗原质量各异，可能影响检测效果。

狂犬病是目前病死率最高的人兽共患病，按照全国畜间人兽共患病防治规划，严格实施犬只免疫和开展监测流调是狂犬病的重点预防措施。因此，ELISA作为检测基层大样本量的快速简便方法，对狂犬病的清除具有重要意义。本次试验发现，国产狂犬病ELISA试剂盒诊断敏感性、诊断特异性、批间稳定性等性能均需进一步提高，但也有综合性能较好的试剂盒，建议在基层犬只狂犬病免疫后抗体水平检测中，可通过与FAVN方法比对，选用与其符合率较高的试剂盒，从而可以准确掌握辖区内的犬狂犬病免疫状况，保障实现区域间犬只免疫抗体合格率达到75%以上的目标。

4 结论

本研究以RV血清中和抗体检测金标准FAVN方法测得的抗体效价为标准，评估了4种国产狂犬病ELISA试剂盒的诊断敏感性、诊断特异性等性能参数，发现不同的国产试剂盒诊断性能存在一定差异，整体来看诊断特异性普遍较低，各项检测性能还需进一步提升，实际应用时应与FAVN方法进行比对，筛选性能最佳的试剂盒用于犬只狂犬病免疫后抗体水平监测与评估。