鲜竹沥气相色谱特征图谱建立及不同炮制方法质量评价*

肖小武，刘静佳，洪挺，付辉政，罗跃华，周志强△

（1.江西省药品检验检测研究院·江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心·国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西 南昌 330029；2.南昌理工学院，江西 南昌 330044）

鲜竹沥为禾本科刚竹属的数种竹子的鲜杆经加热后自然沥出的液体，具有清热化痰、镇惊利窍功效，主要用于肺热咳嗽痰多、壮热烦渴、小儿痰热惊风等，《本草衍义》称之为痰家之圣剂［1］，主产于江西。截至2022年12 月31日，在国家药品监督管理局网站数据中库查询到鲜竹沥单方及复方制剂批准文号43个。其中，鲜竹沥单方制剂文号24个；鲜竹沥复方制剂文号有19个，涉及全国多地区的多家生产企业。鲜竹沥现行质量标准收载于1992年版《中华人民共和国卫生部药品标准 中药材（第一册）》，质量标准仅有性状、酪氨酸薄层色谱鉴别及pH 值、总固体、相对密度检查项，不足以全面反映鲜竹沥质量的优劣。鲜竹沥的炮制方法包括传统的直火烧制法、模仿倒悬炭火逼干馏法、直接水煮法、水蒸气蒸馏法等。炮制方法及生产工艺不同，造成不同厂家和同一厂家、不同批次样品的质量存在差异。中药特征图谱是一种综合、可量化的鉴定手段，主要用于评价中药材及其制剂质量的真实性、稳定性、一致性等，中药特征图谱能全面反映中药化学成分的种类和数量，进行整体质量控制、评价和描述［2-3］。鲜竹沥主要含有酚类、木质素、氨基酸等成分［4-5］，且酚类成分为药效成分［6-8］。目前，主要集中在单组分酚类、糖、氨基酸等成分的含量测定，未见鲜竹沥特征图谱的相关研究报道［9-12］。为此，本研究中在前期研究基础上［13-14］建立了鲜竹沥的气相色谱（GC）法特征图谱的检测方法，并用于评价不同炮制方法鲜竹沥的质量，以全面控制和评价鲜竹沥的质量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

8890B型气相色谱仪（美国Agilent公司），配有氢火焰离子化检测器（FID），7693型液体自动进样器，Openlab色谱工作站；BT25S型电子天平（瑞士赛多利斯公司，精度为十万分之一）；Milli-Q 型超纯水仪（美国Milli-pore公司）。

1.2 试药

愈创木酚对照品（批号为111510-200202，纯度为100.0%），4-甲基愈创木酚对照品（批号为AL190815-27，纯度为99.98%），苯酚对照品（批号为G181013-04，纯度为99.61%），甲基苯酚对照品（批号为G201021-05，纯度为99.34%），乙基苯酚对照品（批号为G191026-03，纯度为99.41%），6-甲氧基愈创木酚对照品（批号为MA190816-07，纯度为99.08%），均购于中国食品药品检定研究院；鲜竹沥共19 批（编号为S1-S19），分别来自江西省的上饶、九江、宜春及湖南省的怀化等，竹子基原均经江西省林业科学院竹类研究所余林副研究员鉴定为正品，样品信息见表1。

表1 鲜竹沥样品信息Tab.1 Information of fresh bamboo sap samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：DB-WAX柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；初始温度：75 ℃；程序升温：以5 ℃/ min 的速率升至150 ℃、保持0.5 min，再以3 ℃/min的速率升至210 ℃、保持0.5 min；载气：99.999%N2；柱流速：3.5 mL/min；进样口温度：260 ℃；FID 温度：300 ℃；进样量：1 μL；分流比：50∶1。

2.2 溶液制备

取6-甲氧基愈创木酚对照品适量，精密称定，用甲醇制成质量浓度为0.03 mg/mL 的溶液，即得对照品溶液。精密量取鲜竹沥30 mL，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，低温旋干，残渣加甲醇溶解并定容至5 mL，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

精密度试验：取样品（编号为S1），按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6次，以7号峰6-甲氧基愈创木酚为参照峰，计算各特征峰与参照峰相对保留时间的RSD。结果13 个共有特征峰相对保留时间的RSD≤0.01%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（编号为S1），按2.2 项下方法制备供试品溶液，分别于0，4，8，12，16，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定，以7 号峰6-甲氧基愈创木酚为参照峰，计算各特征峰与参照峰相对保留时间的RSD。结果13 个共有特征峰相对保留时间的RSD≤0.02%（n=6），峰面积的RSD≤1.5%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取（编号为S1）样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，平行6份，按2.1 项下色谱条件进样测定，以7号峰6-甲氧基愈创木酚为参照峰，计算各特征峰与参照峰相对保留时间的RSD。结果13 个共有特征峰相对保留时间的RSD≤0.02%（n=6），峰面积的RSD≤2.5%（n=6），表明方法重复性良好。

耐用性试验：取样品（编号为S1），按2.2 项下方法制备供试品溶液，选择不同色谱柱（DB-WAX柱、HPINNOWAX柱，SH-Rtx-WAX 柱）考察方法耐用性，均以7 号峰6-甲氧基愈创木酚为参照峰，计算各特征峰与参照峰相对保留时间的RSD。结果13 个共有特征峰相对保留时间的RSD≤0.5%，峰面积的RSD≤2.0%，表明方法耐用性良好。

2.4 对照特征图谱建立

取19 批（编号为S1-S19）样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，得19批样品的色谱图。可见，直火烧制法和干馏法的样品（编号为S1-S13）有共有色谱峰，而水煮法和水蒸气蒸馏法的样品（编号为S14-S19）除溶剂峰外无其他色谱峰。4种炮制方法的典型色谱图见图1。分别将样品（编号为S1-S13）色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版，剪切0～2 min 的溶剂峰，对14 个共有峰进行多点校正，采用Mark 峰匹配，对照特征图谱叠加指纹图谱见图2。采用中药色谱指纹图谱相识度评价2012 版软件对有共有峰的13 批（编号为S1-S12）样品的特征图谱进行比较，确定共有特征峰。生成14 个共有峰构成的对照特征图谱，其中7 号峰6-甲氧基愈创木酚为参照峰，详见图3。

图1 4种炮制方法的典型色谱图Fig.1 Typical chromatograms of fresh bamboo sap prepared by the four processing methods

图2 13批鲜竹沥对照特征图谱叠加指纹图谱Fig.2 Reference characteristic chromatogram superimposed fingerprint of 13 batches of fresh bamboo sap

图3 对照特征图谱Fig.3 Reference characteristic chromatogram

2.5 特征图谱色谱峰确认

取愈创木酚、4-甲基愈创木酚、苯酚、甲基苯酚、乙基苯酚、6-甲氧基愈创木酚对照品各适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以保留时间对供试品溶液色谱图的主要色谱峰进行指认，结果见图4。其中，4 号峰为愈创木酚，5 号峰为4-甲基愈创木酚，6 号峰为苯酚，7 号峰为6-甲氧基愈创木酚，8 号峰为对甲基苯酚，9号峰为对乙基苯酚。

2.6 相似度评价

采用中药色谱指纹图谱相识度评价系统2012版软件对13 批样品（编号为S1-S13）的特征图谱与生成的对照特征图谱的相似度进行评价，结果相似度均大于0.990；而水煮法和水蒸气蒸馏法的样品（编号为S14-S19）除溶剂峰外无其他色谱峰，故无法计算相似度。结果见表2。

表2 气相色谱特征图谱相似度评价结果Tab.2 Results of similarity evaluation of GC characteristic chromatogram

3 讨论

3.1 提取溶剂选择

4.愈创木酚 5.4-甲基愈创木酚 6.苯酚 7.6-甲氧基愈创木酚 8.对甲基苯酚 9.对乙基苯酚图4 对照特征图谱色谱峰指认结果4.Guaiacol 5.4-Methylguaiacol 6.Phenol 7.6-Methoxy-guaiacol 8.4-Methylphenol 9.4-EthylphenolFig.4 Identification of chromatographic peaks of reference characteristic chromatogram

曾考察水饱和正丁醇、乙酸乙酯、乙醚3 种试剂作为提取溶剂的提取效果。结果表明，用水饱和的正丁醇提取时的色谱峰明显少于乙酸乙酯和乙醚，不利于样品整体情况的表征，而用乙酸乙酯和乙醚提取时的色谱峰数量相当，考虑到乙醚试剂的安全性及管控性。最终选择乙酸乙酯为提取溶剂。

3.2 色谱柱选择

曾考察HP-5 弱极性柱、DB-17 中等极性柱、DB-WAX 强极性柱规格相同但固定相不同的毛细管色谱柱。结果HP-5 柱存在分离效果不佳，DB-WAX 柱因对分析物的色谱吸附能力强，导致大部分色谱峰都集中在25～30 min 保留时间处出峰，综合各色谱峰的分离度、保留时间分布分离度，最终选择DB-WAX 柱。

3.3 升温程序及分流比选择

考察了多种色谱柱程序升温及分流比，按拟订色谱条件，各色谱峰分离均大于1.5，色谱峰峰形对称且14 个共有特征峰保留时间分布较平均，其他条件下存在色谱峰分离度不达标或峰形不对称等现象。

3.4 图谱特征

目前，鲜竹沥的生产工艺较粗放，且大部分工艺参数是通过人工控制或经验判断，导致其特征峰峰面积相差较大。故建立了鲜竹沥的特征图谱进行质量控制和评价。

3.5 方法评价

由图2 可知，干馏法和直火烧制法均有14 个共有色谱峰，其中大部分指认为酚类成分，而水蒸气蒸馏法和水煮法均不含上述酚类化合物。酚类成分是鲜竹沥止咳化痰的有效成分。研究报道，禾本科植物竹子中含有大量木质素［15］，且木质素在高温下裂解成苯酚类对羟基苯基（H）型、愈创木酚类的愈创木基（G）型、6-甲氧基愈创木酚类紫香丁（S）型及3-甲氧基邻苯二酚类邻苯二酚（C）型不同类型酚类成分［16-18］，上述酚类化合物跟特征图谱指认峰的结构相吻合。可见，直接烧制法与干馏法均可将竹子中的木质素裂解，而水煮法和水蒸气蒸馏法的温度达不到木质素裂解成酚类化合物的温度。按现行标准规定，鲜竹沥为经直接加热自然沥出的液体，故可认为水煮法和水蒸气蒸馏法制备的非自然沥出的液体为鲜竹沥的非法制备工艺。建议采用特征图谱对不同制备工艺制备的鲜竹沥进行质量评价，以及对非法工艺进行区分。