中成药中沙门氏菌环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用*

冯润东，贾首前，王莉芳，杨晓莉，徐长根△，张鸿豪

（1.陕西省食品药品检验研究院，陕西 西安 710065；2.国家药品监督管理局药品微生物检测技术重点实验室，陕西 西安 710065；3.陕西省药品监督管理局，陕西 西安 710065）

沙门氏菌Salmonella为常见人畜共感染的革兰阴性杆菌［1］。据统计，全世界每年因沙门氏菌感染而发病的人口达9 000万，死亡15.5 万［2］。沙门氏菌在自然界分布广泛，且可在动植物体内定植，而中成药大多由动植物加工炮制而成，且在大量丸散膏丹的方剂中常以原粉入药，故中成药中沙门氏菌的监测是药品质量评价的重要指标。沙门氏菌的检验方法主要包括生理生化法、免疫学方法及分子生物学方法［3］。2020 年版《中国药典》中，沙门氏菌的检测仍采用传统培养分离法［4］，操作简单、成本低，但操作过程及检测周期长，在快速、特异检测方面具有一定局限性［5-6］。其他各种检测方法灵敏、迅速，但需昂贵、庞大的仪器设备和复杂烦琐的电泳过程等，在药品检测中的应用较少。环介导等温扩增（LAMP）为一种新型恒温核酸扩增技术［7］，其特点是针对靶基因的6 个区域设计4 条特异性引物，利用具有链置换活性的DNA 聚合酶，在等温条件下连续扩增，试验过程快速、简便，检测结果特异性强、灵敏度高，已被广泛应用于致病微生物的检测，有关沙门氏菌的检测方法也有研究。欧新华等［8］建立了基于LAMP 技术的沙门氏菌属检测方法，并经电泳法评价其效果。刘卫德等［9］建立了检测中成药中沙门氏菌的实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）法。虽然采用的检测方法多样，但检测效果不一，尤其是涉及中成药中沙门氏菌LAMP检测的实际应用报道较少。为探索分子生物学方法在中成药沙门氏菌检测中应用的可行性，本研究中基于LAMP 技术原理，以沙门氏菌4 个亚种毒理因子invA 基因作为检测模板，并设计特异性引物，建立简便、高效的中成药沙门氏菌的特异性检测方法，为快速检测药品中的沙门氏菌提供参考。现报道如下。

1 仪器、试药与菌株

1.1 仪器

ZHTY-50ES型振荡培养箱（上海知楚仪器有限公司）；202-2A 型恒温培养箱（天津泰斯特仪器有限公司）；Eppendorf Mini Spain 型离心机（德国艾本德股份公司）；StepOne Plus 型实时荧光定量PCR 仪（赛默飞世尔仪器有限公司）；MBE200A 型蓝光切胶仪（苏州宇恒生物科技有限公司）。

1.2 试药

Bst DNA 聚合酶（批号为B110061），脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP，10 mmol/L，批号为B500056），均购自生工生物工程＜上海＞股份有限公司；MgSO4（100 mmol/L），50×LAMP 荧光染料，亚硒酸盐煌绿增菌液，生化试剂，均购于西安晶博生物科技有限公司；9 批次待检药品均为市售，药品信息见表1。

表1 待检药品信息Tab.1 Information of drugs to be detected

1.3 菌株

沙门氏菌属：甲型副伤寒沙门氏菌Salmonella paratyphiA，乙型副伤寒沙门氏菌Salmonella paratyphiB，丙型副伤寒沙门氏菌Salmonella paratyphiC，鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium，金黄色葡萄球菌Staphylo-coccus aureus，大肠杆菌Escherichia coli，产志贺氏毒素大肠埃希氏菌Shiga toxin-producingEscherichia coli（STEC），均购自北纳生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 LAMP 引物设计及合成

选择沙门氏菌invA 基因，根据GenBank 数据库中提供的沙门氏菌特异基因组序列进行序列比对，寻找一段高度保守区作为扩增对象，通过Primer Exploer V5软件设计3 组LAMP 引物，分别为正向外引物（F3）、反向外引物（B3），正向内引物（FIP）、反向内引物（BIP），正向环引物（LF）、反向环引物（LB）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表2。

表2 沙门氏菌invA基因的LAMP检测用引物序列Tab.2 Primer sequences for LAMP detection of invA gene of Salmonella

2.2 细菌DNA 模板制备

取细菌培养物1 mL，置1.5 mL EP管中，以12 000 r/min的转速离心5 min，收集菌液，弃上清液。加入100 μL DNA 提取液，混匀，金属浴100 ℃加热保温10 min，以12 000 r/ min 的转速离心5 min，将上清液转移至另一EP管中，作为DNA模板，-20 ℃保存备用。

2.3 引物筛选

将上述合成的LAMP 引物按浓度比例F3-B3-LF-LB-FIP-BIP（1∶1∶2∶2∶4∶4）进行配制。以沙门氏菌基因组DNA 为模板，采用以下LAMP 反应体系及检测条件进行扩增，筛选最佳引物组。

LAMP反应体系［10］（10μL）：取ddH2O2.8μL，LAMP缓冲液1μL，dNTPs（1.6 mmol/ L）1.4 μL，MgSO4（8 mmol/ L）0.6 μL，甜菜碱（1 mol/ L）2 μL，Bst DNA 酶（8 U/ μL）0.4 μL，染料（1.6 mmol/ L）0.4 μL，引物（10 μmol/ L）0.4 μL，制备预混合溶液。每个反应管加入9 μL 预混合溶液，再加入1 μL 供试品溶液及对照品溶液，并设空白对照。后续试验溶液的配制同此。

LAMP 检测条件：反应混合物在实时荧光定量PCR仪检测系统进行LAMP 反应，反应温度为65 ℃，反应时间为60 min。试验结果以扩增曲线、产物电泳或在蓝光切胶仪下以阳性和阴性对照为基准目测进行判定。

最优引物筛选：分别用3 组引物进行LAMP 扩增，反应产物在蓝光切胶仪下以阳性和阴性对照为基准进行目测（图1 A），结果阳性反应液为黄色，阴性反应液为橙色，该反应结果基于扩增反应的微量pH 变化进行检测［10］。由反应产物电泳图（图1 B）可见，阳性对照泳道中出现特异性扩增产物，而阴性对照泳道中无条带，表明invA 基因引物组2为最优引物。

M.Marker 1.阳性对照 2-8.阴性对照A.蓝光灯下结果 B.琼脂糖凝胶电泳结果图1 invA基因引物组LAMP扩增特异性评价M.Marker 1.Positive control 2-8.Negative controlA.Results visualized with blue lamp B.Results of agarose gel electrophoresisFig.1 Evaluation of LAMP amplification specificity of invA gene primer groups

2.4 方法学考察

特异性试验：为了验证引物对沙门氏菌检测的特异性，于37 ℃条件下培养后，用2.3 项下反应体系及检测条件，以4株阳性对照沙门氏菌、3株非沙门氏菌细菌培养物获得的DNA 为模板进行LAMP 扩增检测，以不含DNA 模板的阴性质控品作为阴性对照，验证引物特异性，重复试验3 次。采用建立的沙门氏菌LAMP 检测方法对7株细菌进行检测，菌株来源见表3，特异性检测结果见图2。反应产物在蓝光切胶仪下以阳性和阴性对照为基准进行目测，结果见图2 A。可见，沙门氏菌属的检测结果中，阳性反应液为黄色（4 株沙门氏菌亚种均为阳性），阴性及空白对照反应液为橙色。由图2 B 可见，1，2，3，4泳道中均出现特异性扩增产物，而5，6，7及无菌水（空白对照）泳道中均无扩增条带，表明invA 基因引物特异性较好。

表3 试验菌株来源Tab.3 Sources of test strains

1.甲型副伤寒沙门氏菌 2.乙型副伤寒沙门氏菌 3.丙型副伤寒沙门氏菌 4.鼠伤寒沙门氏菌 5.大肠杆菌 6.金黄色葡萄球菌 7.产志贺氏毒素大肠埃希氏菌 8.无菌水（空白对照）A.蓝光灯下结果 B.琼脂糖凝胶电泳结果图2 沙门氏菌LAMP特异性试验检测结果1.Salmonella paratyphi A 2. Salmonella paratyphi B 3. Salmonella paratyphi C 4.Salmonella typhimurium 5.Escherichia coli 6.Staphylococcus aureus 7.Shiga toxin-producing Escherichia coli（STEC）8.Sterile water（blank control）A.Results visualized with blue lamp B.Results of agarose gel electrophoresisFig.2 Results of LAMP specificity test of Salmonella

灵敏度试验：取营养琼脂平板上新鲜生长的沙门氏菌BNCC336664 单菌落接种于LB 肉汤中，以180 r/min的转速离心5 min，37 ℃培养24 h后，吸取1 mL 菌悬液置9 mL 无菌生理盐水中，依次稀释，分别得浓度为101，102，103，104，105，106，107cfu/ mL 的7 份纯菌稀释液样品。分别取上述7 份样品制备对应的DNA 模板1 μL，采用2.3项下方法进行LAMP反应，每份样品DNA 模板设3个平行试验。沙门氏菌原菌液浓度为108cfu/mL，10 倍倍比稀释后，模板量分别为3×107～3×100cfu/mL，阴性对照为超纯水，对系列稀释菌液进行LAMP 检测。结果见图3。可见，沙门氏菌以invA 基因引物进行LAMP扩增的检测灵敏度可达3×101cfu/mL。

1.超纯水（阴性对照）2.107 cfu/mL 3.106 cfu/mL 4.105 cfu/mL 5.104 cfu/mL 6.103 cfu/mL 7.102 cfu/mL 8.101 cfu/mL 9.100 cfu/mL图3 沙门氏菌LAMP灵敏度试验结果1.Ultra-pure water（negative control）2.107 cfu/mL 3.106 cfu/mL 4.105 cfu/mL 5.104 cfu/mL 6.103 cfu/mL 7.102 cfu/mL 8.101 cfu/mL 9.100 cfu/mLFig.3 Results of LAMP sensitivity test of Salmonella

基质检测限确定：取亚硒酸盐煌绿增菌液10 mL，置25 mL EP 管中，分别 按107，106，105，104，103，102，101cfu/mL 的浓度加入沙门氏菌液，混匀，以不含菌液的阴性增菌液作为阴性对照，分别取1 mL 菌液提取DNA，进行LAMP 扩增检测。本研究中所建立的LAMP检测限为100 cfu/ mL，检测微量污染沙门氏菌的样品需通过增菌达到更高的灵敏度。对细菌浓度为3×107，3×106，3×105，3×104，3×103，3×102，3×101cfu/mL的模拟增菌液样本进行LAMP 检测，检测结果见图4。可见，在细菌浓度为3×102cfu/mL 时仍可扩增出特异性产物。

2.5 样品检测

2-7.模板量为3×107～3×102 cfu/mL图4 基质中沙门氏菌LAMP检测限测定结果2-7.Templates：3×107-3×102 cfu/mLFig.4 Results of limit of detection determination of LAMP of Salmonella in matrix

取1.2 项下待测药品各10 g 或10 mL，置无菌锥形瓶中，加亚硒酸盐煌绿增菌液至200 mL，作为供试品溶液；另加入1 mL低于103cfu/mL的沙门氏菌液，同法制备供试液，作为阳性对照溶液；于无菌锥形瓶中加入亚硒酸盐煌绿增菌液至200 mL，作为阴性对照溶液。上述溶液分别置37 ℃、180 r/ min 恒温培养箱中过夜培养12 h后，按2.2 项下方法提取基因组DNA，采用建立的LAMP 方法进行检测，反应产物琼脂糖凝胶电泳结果见图5。可见，阳性对照溶液泳道有特异性扩增，所有供试品溶液和阴性对照溶液泳道均无特异性扩增，说明9批次样品均未污染沙门氏菌。

M.Marker DL 2000 N，N'.阴性对照溶液 P.阳性对照溶液1.排毒养颜胶囊 2.川贝枇杷露 3.川贝枇杷膏 4.强力枇杷露 5-8.桑菊感冒片 9.黄连上清丸图5 9批次中成药沙门氏菌LAMP检测结果M.Marker DL 2000 N，N'.Negative control P.Positive control 1.Paidu Yangyan Capsules 2.Chuanbei Pipa Syrup 3.Chuanbei Pipa Concentrated Decoction 4.Qiangli Pipa Syrup 5-8.Sangju Cold Tablets 9.Huanglian Shangqing PillsFig.5 Results of Salmonella detection by LAMP in nine batches of Chinese patent medicine

3 讨论

基因的筛选是沙门氏菌检测的关键步骤，invA 基因具有属特异性，是沙门氏菌属检测的常用靶基因［11-12］。经生物信息学分析与综合测试评估，invA 在沙门氏菌中的特异性能为97.6%～97.8%［13-14］，达到理想靶标检测要求，故本研究中选用invA 基因进行特异性引物设计。

LAMP 检测对于引物设计的要求较高，反应所需Bst DNA 聚合酶可在特定条件下将寡核苷酸随机掺入有缺口的DNA 模板进行跨片段扩增［15］。另外，环引物的加入可加速LAMP 试验［16］，但同时也增加了引物二聚体形成非特异性扩增的可能性，故引物设计不合理易出现假阳性现象。本研究中设计了3组沙门氏菌invA特异性基因，每组筛选6条引物，引物特异性良好，试验过程中未出现假阳性现象。

本研究中以甲型副伤寒沙门氏菌Salmonella paratyphiA、乙型副伤寒沙门氏菌Salmonella paratyphiB、丙型副伤寒沙门氏菌Salmonella paratyphiC、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium的invA 基因为检测目标，经过引物设计、引物筛选、引物特异性试验、灵敏度检测、基质中检测限测试及前增菌培养，成功构建了中成药中4 个亚种沙门氏菌的LAMP 快速检测方法，其最佳反应温度为65 ℃，反应时间为60 min，方法灵敏度可达101cfu/mL。采用新建立的LAMP 方法测定了模拟样本亚硒酸盐煌绿增菌液中的沙门氏菌，其灵敏度与细菌直接提取DNA 进行LAMP 测定结果相同，且干扰较小。本试验根据扩增曲线、产物电泳及荧光检测判定LAMP 检测结果，证明LAMP 快速检测方法检测沙门氏菌的特异性和灵敏度较好，4 株沙门氏菌扩增结果显示均为阳性，其余3 种对照细菌扩增结果显示均为阴性。本方法从DNA 提取开始，约1.5 h 即可完成试验，大大减少了检测周期。其扩增反应在65 ℃恒温条件下即可完成，不需使用特殊的仪器设备，操作简便，LAMP 技术在普通实验室条件下即可实现［17］。采用LAMP 方法快速初检后，初筛呈阳性的样本再用常规培养法进行验证，可缩短检测周期，减少了工作量，有效降低了检测成本。

本研究中建立的LAMP 快速检测方法能在24 h 内完成中成药中沙门氏菌的检测，具有检测时效短、特异性强、灵敏度高、不易交叉污染等优势，成为《中国药典》方法的有效补充。此外，本研究中建立的方法经适当调整后还可应用于中药材、中药饮片、保健食品等原料中沙门氏菌污染的监测工作，有较好的推广应用前景。