小儿黄龙颗粒治疗注意缺陷多动障碍的网络药理学和分子对接研究

韦春香，郑义翔，周雪，刁俊林△

（1.重庆市精神卫生中心，重庆 401147；2.西南大学医学研究院，重庆 400715）

注意缺陷多动障碍（ADHD）是一种以多动、冲动和注意力缺陷为特征的神经发育障碍，属中医心肝系疾病范畴，多发于儿童［1］，超过2/3 患儿的症状会持续至成年期，导致严重的终身损害［2］。ADHD 发病机制复杂，目前主要采用药物治疗。西药有哌甲酯和托莫西汀［3］，但会引起头痛、失眠等药品不良反应，患者依从性较低。中药小儿黄龙颗粒具有滋阴潜阳、安神定志功效，能改善ADHD 患儿的多动不宁、神思涣散、多言多语、性急易怒等症状，安全性和有效性均较好［4］。本研究中采用网络药理学方法分析了小儿黄龙颗粒的活性成分，并预测治疗ADHD 的潜在作用靶点和作用机制，为其临床研究提供参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 活性成分及靶点预测

在TCMSP 数据库（http：// tcmsp-e.com/ tcmsp.php）中，以“熟地黄”“白芍”“知母”“五味子”“党参”“石菖蒲”“桔梗”为关键词检索小儿黄龙颗粒的活性成分，并进行整合、去重；以化合物的口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 为条件筛选有效成分，并结合已发表的文献进行补充。在TCMSP 数据库中检索活性成分对应靶点，并通过UniProt 数据库（https：// www.uniprot.org）规范靶点名称。

1.2 靶点筛选

以“Attention deficit hyperactivity disorder”为关键词，在DisGeNET 数据库（https：// www.disgenet.org）、GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）、ADHDgene数据库（http：//adhd.psych.ac.cn/）、TTD数据库（https：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank数据库（https：//go.drugbank.com）中检索ADHD 的相关靶点，合并各数据库靶点后去重，通过Uniprot 数据库规范靶点名称。通过Venny 2.1 平台对小儿黄龙颗粒活性成分靶点与ADHD 靶点取交集，获取共有靶点，即为小儿黄龙颗粒治疗ADHD的潜在作用靶点；获取共有靶点对应的活性成分，采用Cytoscape 3.8.0软件构建小儿黄龙颗粒治疗ADHD活性成分-共有靶点网络，度值排名靠前的成分为小儿黄龙颗粒治疗ADHD的关键成分。

1.3 潜在作用靶点蛋白互作网络（PPI）构建

将共有靶点导入String数据库（https：//www.stringdb.org）构建PPI，物种设置为“Homo sapiens”，靶点关联置信度设置为0.40，其余参数为默认值，获取蛋白互作信息［5］。采用Cytoscape 3.8.0 软件生成PPI 中的核心靶点图，采用该软件中的CytoHubba 插件和Betweenness算法计算网络的核心靶点。

1.4 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

利用Metascape数据库（https：//metascape.org/gp/index.html#/ main/ step1）对共有靶点进行GO 富集分析［生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）］及KEGG 通路富集分析。以P≤0.01 为筛选条件，采用R 4.0.2 软件对lgP排名前20 的结果进行可视化处理，并绘图呈现富集结果。

1.5 活性成分-靶点-通路网络构建

将共有靶点、小儿黄龙颗粒活性成分及KEGG通路富集分析的相互作用信息合并，采用Cytoscape 3.8.0软件构建活性成分-靶点-通路网络，并通过节点度、中心度、紧密度等网络拓扑参数分析靶点及活性成分。

1.6 分子对接验证

以1.3 项下的核心靶点为受体，以其在1.2 项下小儿黄龙颗粒活性成分-共有靶点网络中对应的关键成分为配体，进行分子对接验证。通过RCSB PDB 数据库（https：// www.rcsb.org）下载核心靶点的三维晶体结构，保存为pdb格式文件；采用PyMol 2.5.2软件去除蛋白结构中的水分子和小分子配体，采用AutoDockTools 1.5.6 软件进行加氢、去电荷等预处理，保存为pdbqt格式文件。通过TCMSP 数据库下载活性成分的分子结构，保存为mol2格式文件，通过Open Babel 2.4.1软件转换为pdb格式文件；采用AutoDockTools 1.5.6软件对活性成分配体进行能量最小化处理，赋予配体原子类型，计算电荷，保存为pdbqt 格式文件。运行AutoDockTools 1.5.6 软件，采用遗传算法进行分子对接操作，以结合能评估对接结果，结合能越低，表明配体与受体的结合力越强。结合能＜-4.25 kcal/mol，受体、配体间有一定的结合活性；结合能≤-5.0 kcal/ mol，二者间有较好的结合活性；结合能≤-7.0 kcal/ mol，二者间有较强的结合活性［6］。

2 结果

2.1 活性成分和靶点

共获得47种活性成分（表1），合并其预测靶点并去除重复基因后，共获得163个靶点。

表1 小儿黄龙颗粒中47种活性成分基本信息Tab.1 Information of 47 active components of Xiaoer Huanglong Granules

2.2 靶点构建与分析

在DrugBank，GeneCards，DisGeNET，TTD，ADHDgene数据库中获得ADHD疾病靶点个数分别为82个、1 890个（经筛选后为881 个）、24 个、40 个、359个，汇总并删除重复靶点，最终获得靶点1 115个。将小儿黄龙颗粒活性成分的163个靶点与ADHD的1 115个靶点导入Venny 2.1平台，共获得55 个共有靶点，即为小儿黄龙颗粒治疗ADHD的关键靶点。详见图1。

图1 小儿黄龙颗粒活性成分和ADHD交集靶点维恩图Fig.1 Venn diagram of targets of active components of Xiaoer Huanglong Granules and ADHD

在Cytoscope 3.8.0 软件中构建的小儿黄龙颗粒活性成分-共有靶点网络见图2。网络中，共101个节点和227条边，根据度值筛选前5个成分分别为D（豆甾醇）、DS5（7-甲氧基-2-甲基异黄酮）、C（山柰酚）、BS4（β-谷甾醇）、A（木犀草素），这些成分可能是小儿黄龙颗粒治疗ADHD的关键成分。

图2 小儿黄龙颗粒治疗ADHD活性成分-共有靶点网络Fig.2 Network of active components-common targets of Xiaoer Huanglong Granules in the treatment of ADHD

2.3 潜在作用靶点的PPI

将55个共有靶点导入String数据库，获取网络信息后，采用Cytoscape 3.8.0 软件构建PPI（图3），该网络包括55 个节点和311 条边，颜色由红到蓝代表靶点在PPI中的相互作用由强到弱。利用Cytoscape 3.8.0 软件中CytoHubba插件及Betweenness算法对网络进行分析，获取核心靶点（图4）。结果表明，白细胞介素6（IL-6）、蛋白激酶1（AKT1）、雌激素受体1（ESR1）、溶质载体家族6 成员4（SLC6A4）、肾上腺素能受体β2（ADRβ2）和烟碱型胆碱受体α7（CHRNα7）6 个靶点在整个网络中起关键作用，预测其为小儿黄龙颗粒治疗ADHD 的核心靶点。

图3 小儿黄龙颗粒治疗ADHD潜在作用靶点的PPIFig.3 PPI network of potential targets of Xiaoer Huanglong Granules in the treatment of ADHD

图4 PPI中的核心靶点Fig.4 Core targets in PPI network

2.4 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

A.BP分析 B.CC分析 C.MF分析图5 小儿黄龙颗粒治疗ADHD的GO富集分析条形图A.BP analysis B.CC analysis C.MF analysisFig.5 Bar chart of GO enrichment analysis of Xiaoer Huanglong Granules in the treatment of ADHD

对55 个共有靶点进行GO 富集分析，将BP，CC，MF 分析结果绘制为条形图（图5），横轴代表关键节点的数量，颜色由黄到紫代表lgP由大到小。结果显示，小儿黄龙颗粒治疗ADHD 主要涉及突触传递、细胞对有机环状化合物及含氮化合物的反应等BP，突触后膜、树突及膜筏等CC，神经递质受体活性、G 蛋白偶联胺受体活性及单加氧酶活性等MF。将KEGG 通路富集分析结果绘制为气泡图（图6），横轴代表富集在该通路的靶点占所有共有靶点的百分比，气泡大小代表富集在该通路的靶点数量，颜色由紫到红代表lgP由大到小。结果显示，小儿黄龙颗粒治疗ADHD 的关键通路包括神经活性配体-受体相互作用、钙离子信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/ 丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信号通路、环磷酸鸟苷/蛋白激酶G（cGMP/PKG）信号通路及胆碱能突触信号通路等。

图6 小儿黄龙颗粒治疗ADHD的KEGG通路富集分析气泡图Fig.6 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis of Xiaoer Huanglong Granules in the treatment of ADHD

2.5 活性成分-靶点-通路网络

通过Cytoscape 3.8.0 软件构建小儿黄龙颗粒活性成分-靶点-通路网络（图7），包括96个节点和384条边。每种活性成分都对应多个靶点，体现了小儿黄龙颗粒多种成分通过多靶点、多通路发挥治疗ADHD的作用。

图7 小儿黄龙颗粒治疗ADHD活性成分-靶点-通路网络Fig.7 Network of active components-targets-pathways of Xiaoer Huanglong Granules in the treatment of ADHD

2.6 分子对接

将2.3项下6个核心靶点IL-6，AKT1，ESR1，SLC6A4，ADRβ2，CHRNα7 与5 个关键成分豆甾醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素进行分子对接，最终获得12 组受体-配体对接结果（表2）。结果显示，关键成分与核心靶点的结合能均小于-4.25 kcal/ mol，其中小于-5.0 kcal/ mol 的组合共9 组（75.00%），提示所筛选的关键成分与核心靶点间具有较好的结合活性。木犀草素与IL-6（结合能-5.12 kcal/ mol）及β-谷甾醇与CHRNα7（结合能-5.84 kcal/mol）分子对接结果见图8。

表2 小儿黄龙颗粒治疗ADHD的关键成分与对应核心靶点的结合能Tab.2 Binding energy of key components of Xiaoer Huanglong Granules in the treatment of ADHD and corresponding core targets

A.木犀草素-IL-6 B.β-谷甾醇-CHRNα7图8 小儿黄龙颗粒治疗ADHD的分子对接结果A.Luteolin-IL-6 B.β-Sitosterol-CHRNα7Fig.8 Results of molecular docking of Xiaoer Huanglong Granules in the treatment of ADHD

3 讨论

ADHD是因先天禀赋不足、后天调护不当导致的脏腑功能失常，其主要病变在心、肝、脾、肾［7］，故针对此病可按泻实补虚、调和脏腑、平衡阴阳的基本原则辨证论治，中医辨证以肾阴不足、肝阳偏亢症（阴虚阳亢证）多见。小儿黄龙颗粒具有滋阴潜阳、安神定志功效，是中医辨证治疗ADHD的良药。

目前，公认的ADHD 发病机制是儿茶酚胺类神经递质去甲肾上腺素和多巴胺代谢障碍导致的脑功能轻度缺陷。小儿黄龙颗粒的有效成分山柰酚是一种天然的可食用黄酮类化合物，主要来源于姜科植物山柰的根茎，广泛存在于各种蔬菜和水果中，具有抗炎、抗氧化、抗缺血损伤、抗惊厥、抗抑郁、抗痴呆等多种神经系统作用［8］。动物体内研究显示，山柰酚能通过提高线粒体和整个细胞质钙离子水平来增加钙离子单向转运体的活性［9］，从而促进去甲肾上腺素和多巴胺的释放［10］。β-谷甾醇能显著增加小鼠大脑中去甲肾上腺素、5-羟色胺和代谢物5-羟基吲哚乙酸的水平［11］。KEGG 通路富集分析结果显示，多巴胺与去甲肾上腺素受体相关基因大多富集在神经活性配体-受体相互作用通路、钙离子信号通路、cGMP/PKG 信号通路等。故山柰酚和β-谷甾醇可能通过影响儿茶酚胺类神经递质水平及调控上述信号通路，发挥ADHD的治疗作用。

研究表明，免疫系统可能参与包括ADHD 在内的各种发育障碍的发病机制［12］。既往研究显示，ADHD 患儿血清中的IL-6 和肿瘤坏死因子（TNF）水平均明显升高，且与儿童注意问题、违纪行为、攻击行为等相关［13］。木犀草素是一种广泛存在于植物中的黄酮类化合物，可通过降低蛋白激酶C的活性及抑制钙离子内流来阻止肥大细胞的活化，从而减少TNF-α、IL-6、白三烯的等炎性介质的释放［14］，还可抑制小胶质细胞和星形胶质细胞释放IL-6。KEGG通路富集分析结果显示，木犀草素治疗ADHD 的作用可能与白细胞介素17（IL-17）信号通路密切相关。

CHRNα7在大脑和外周广泛表达，作为炎性反应的效应点，与迷走神经释放的抗炎递质乙酰胆碱结合，通过信号转导抑制促炎因子的生成和释放，在胆碱能抗炎途径中起重要作用［15］。CHRNα7 对钙离子具有高渗透性，不仅可作为离子通道，还可作为钙活化信号通路的调节剂，在认知和免疫系统中具有多种重要作用，与ADHD 的发病机制密切相关［16］。豆甾醇是一种天然存在的植物激素，具有抗炎、抗氧化、降低胆固醇等作用［17］。YADAV 等［18］研究发现，豆甾醇能降低乙酰胆碱酯酶活性，明显减轻由氯胺酮引起的小鼠自发活动、刻板行为等精神疾病症状。一项β-谷甾醇治疗阿尔茨海默病的体内外研究结果显示，β-谷甾醇对中枢乙酰胆碱酯酶有抑制作用，随着治疗的进展，β-谷甾醇组小鼠的工作记忆和运动协调能力均逐渐改善［19］。这可能是由于豆甾醇和β-谷甾醇降低乙酰胆碱酯酶活性，减少了对乙酰胆碱的降解，使CHRNα7 的抗炎作用更持久，以及间接激活钙离子信号通路，从而共同发挥治疗ADHD的作用。

雌激素信号通路在调节精神分裂症的阳性症状、双相情感障碍的躁狂症及激素波动引起的认知和情绪中发挥重要作用。研究发现，雌激素受体ESR1 基因内的单核苷酸多态性与包括ADHD 在内的神经、精神疾病相关［20］。豆甾醇可通过激活ESR1 受体或N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体来增强胆碱能神经系统功能，从而发挥改善认知和学习记忆的作用［21］。β-谷甾醇也能通过与HT22 细胞的细胞膜结合，影响雌激素受体激活PI3K 信号通路，增加PI3K 活性，抑制葡萄糖氧化酶所诱导的氧化应激与脂质过氧化反应，进而改善脑代谢［22］。

综上所述，小儿黄龙颗粒主要活性成分豆甾醇、山柰酚、木犀草素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、β-谷甾醇可能通过IL-6，ESR1，ALT，SLC6A4，ADRβ2，CHRNα7 6 个核心靶点作用于神经活性配体-受体相互作用、钙离子信号通路、PI3K/AKT信号通路、cGMPPKG 信号通路、胆碱能突触信号通路治疗ADHD，其过程可能涉及儿茶酚胺类递质的代谢、免疫系统、抗炎途径等生物学过程。