钴掺杂氮化碳传感器电化学检测牛奶中双酚A

汪美凤，王 娣，韦启信*

（1.安庆师范大学 生命科学学院，安徽 安庆 246133；2.安庆师范大学 资源环境学院，安徽 安庆 246133）

双酚A（Bisphenol A，BPA）即二酚基丙烷，是合成聚碳酸酯和环氧树脂的重要单体，普遍存在于罐头食品包装、饮料瓶和医用材料中[1]。BPA易水解，可从制品中释放并由食物链进入人体，能够产生极强的雌激素效应，从而引起人体内分泌系统紊乱，对婴幼儿发育造成不良影响，甚至有致癌风险[2-3]。因此，快速准确地检测牛奶中双酚A的含量对维护食品安全和保障人体健康具有重要意义。

食品中BPA常用的检测方法有液相色谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱-质谱法和酶联免疫吸附分析法等。但是，这些方法大多需要昂贵的仪器设备，且样品前处理繁琐、操作复杂耗时，不适合食品样品的常规快速分析。近年来，分析快速、成本低、操作简单的电化学传感技术受到众多研究者的关注。目前，碳基纳米材料已被广泛用于提高电化学检测的传感性[4]，其中石墨氮化碳（g-C3N4）作为一种SP2共轭体系的碳基半导体材料，其以结构稳定，成本低廉，无毒、易制备等优点而备受学者们关注。

目前，C3N4通常由各种含氮有机单体（如氰胺、三聚氰胺和双氰胺等）高温煅烧所制得，但是该方法制备的C3N4晶面结构杂乱，且具有较大的面间距，易出现严重的团聚现象，从而导致其存在结晶度差、反应位点少、电化学活性弱、应用潜力不足等客观问题[5]。为了改善电化学检测功能材料的块状结构并提升反应活性，本文制备了高活性过渡金属Co掺杂的C3N4复合电极材料，并将其用于巴氏杀菌纯牛奶和超高温瞬时灭菌纯牛奶中BPA含量的电化学检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

巴氏杀菌纯牛奶和超高温瞬时灭菌纯牛奶均购自安庆本地超市。主要化学试剂有CoCl2·6H2O分析纯、乙醇、PBS缓冲溶、Nafion溶液、三聚氰胺分析纯，以及超纯水。

1.2 仪器与设备

主要的仪器设备有FA2204 电子天平（0.001 g，上海津平科学仪器有限公司）、SK2-2-10 马弗炉（上海实严电炉厂）、ESCALAB250Xi X-射线光电子能谱仪（美国Thermo公司）、D/MAX2500VL/PC 转靶X-射线衍射仪（日本理学株式会社）、LabRAM HR Evolution 拉曼光谱（HORIBA Jobin Yvon）、Nicolet IS50 iN10 傅里叶红外光谱仪（Thermo Fisher）、Regulus 8230 FE-SEM（Hitachi）、JEM-2100F 场发射透射电子显微镜（日本电子）、CHI600E 电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）、HJ-1磁力搅拌器（金坛市白塔新宝仪器厂）、HPLC-1100 高效液相色谱仪（安捷伦）和Hypersil-ODS 反相柱（赛默飞）。

1.3 Co-C3N4复合材料的制备

在蓝色透明玻璃试剂瓶中加入100.0 mL超纯水，称取0.17 g CoCl2·6H2O倒入蓝色透明试剂瓶，在磁力搅拌器上搅拌5.0 min，再加入10.0 g三聚氰胺并搅拌8.0 h，然后将试剂瓶于65.0°C的干燥箱中干燥，直到瓶中物质由红色变成蓝色，烘干后用玛瑙研钵研磨成粉末状。取5.0 g 粉末放入氧化铝坩埚中并将其放入管式炉，通氮气10 min 以排净管道中空气，然后以5.0°C/min 加热速度升温至550.0°C，持续4.0 h，待冷却完毕后取出坩埚，将其中块状材料研磨成粉末，并用酒精和超纯水清洗3次，烘干备用[6]。

1.4 工作电极制备

玻碳电极（GCE）表面使用1.0 μm和0.05 μm的Al2O3抛光粉进行抛光，然后经无水乙醇和超纯水超声清洗，并自然晾干。取5.0 μL Co-C3N4分散液滴加到GCE 表面上，并室温干燥2.0 h，然后滴加5.0 μL Nafion溶液，最终得到了Co-C3N4/GCE的修饰电极。

1.5 形貌结构表征

采用高分辨场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）和高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）来观测样品的形态和微观结构，并对其表面元素分布进行分析（能谱EDS）；利用转靶X-射线衍射仪来分析样品的晶相结构；使用FTIR光谱来表征材料的官能团和化学键；使用拉曼光谱来确认Co-C3N4的骨架；通过X-射线光电子能谱研究样品的元素组分和化学结构。

1.6 纯牛奶样品BPA检测

1.6.1 样品预处理

取巴氏杀菌纯牛奶和超高温瞬时灭菌纯牛奶各5.0 mL，分别加入10.0 mL无水酒精并超声15.0 min，摇床摇匀10.0 min，再以10 000.0 r/min转速离心10.0 min后过滤，收集滤液并用pH 7.0的PBS缓冲溶液定容至25 mL。

1.6.2 样品BPA的检测

利用上海辰华CHI660E工作站进行电化学检测实验。在所构建的三电极体系中，以Co-C3N4/GCE（0.096 cm2）为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，Pt丝为对电极，且工作电极与对电极的间距为1.0 cm。测试过程利用线性扫描伏安方法（LSV），对不同牛奶BPA 样品液进行检测[7,15]。具体检测条件：扫描电位0.0～1.0 V，扫速0.025 V/s，采样间隔0.001 V；电解质均为0.1 mol/L的Na2SO4。

1.6.3 加标回收率检测

分别往预处理过的纯牛奶样品中加入1.0 μmol/L、10.0 μmol/L、15.0 μmol/L和100.0 μmol/L的BPA标准液，配得不同浓度的BPA标准样品工作液，对其开展加标回收率检测实验[8]。

2 结果与讨论

2.1 电极形貌结构特性

电极如SEM图1（a,b）所示，C3N4呈现块状结构，但钴掺杂的Co-C3N4样品出现了更多小片状结构和孔隙，具有更大的比表面积，这是由于块状石墨氮化碳层间的堆叠是靠氢键连接，而在金属掺杂过程中片层之间的氢键不能承受所施加的化学能从而达到剥离。从TEM图1（c,d）可以看出，Co-C3N4样品对电子束显示出明显的黑色阴影。与此同时，进行EDS能谱分析以确定其表面组成和元素分布，如图1（e～h）所示，样品元素分布均匀，Co-C3N4中Co信号强度为0.14%，氮含量为71.34%，意味着Co-C3N4暴露了很多Co位点，且具有较少氨基。

图1 Co-C3N4电极形貌特性。（a,b）SEM；TEM（c,d）；（e）C、N、Co的EDS能谱；C(f)，N(g)，Co(h)单独能谱

C3N4和Co-C3N4的XRD见图2（a），其中两者在2θ为13.0°和27.4°时各有两个衍射峰，分别对应三-s-三嗪单元的层内重复堆积和类石墨材料的层间堆积，为（100）和（002）晶（JCPDS-87-1526）。与C3N4的XRD图谱相比，掺杂Co后的Co-C3N4没有显著变化。此外，随着C3N4中Co的掺入，（002）的峰强度降低且变得更宽，意味着Co-C3N4的结晶度随着Co的掺入而降低[9]，并且引入的Co抑制了C3N4的热聚合。另外，未观察到其它衍射峰，同时图1（c,d）的TEM也未观察到可见颗粒或明显的微晶结构，也说明了Co与C3N4的主体化学配位可能是以Co-N键的形式存在，故而进一步证明了Co掺杂成功。

图2 C3N4和Co-C3N4表征。（a）XRD；（b）Raman；（c,d）FTIR

采用拉曼光谱来确认Co-C3N4骨架，如图2(b)所示，在Co-C3N4样品中可以检测到属于C3N4的一系列特征峰。其中，在707 cm-1和975 cm-1处的特征峰对应于三-s-三嗪的平面内弯曲和对称N震动模式，而1 100 cm-1～1 700 cm-1处对应于无序石墨C-N 键振动，这表明C3N4基本框架在Co-C3N4中保持良好[10]。同时，使用FTIR 光谱来表征材料的官能团信息，如图2(c)所示，C3N4和Co-C3N4样品具有相同的光谱信息，可以证明两者具有相同的结构信息，意味着其化学结构在Co 掺杂后没有发生明显变化。其中，3 000 cm-1～3 500 cm-1处的宽吸收带可能归因于未缩合氨基的N-H 键和材料吸附的H2O 分子拉伸振动[11]。出现在1 200 cm-1～1 620 cm-1的强吸收峰是C3N4骨架上碳氮杂环的C=N双键、C-N单键的伸缩振动所造成，而808 cm-1处对应于三-s-三嗪单元的弯曲模式，同时该处的强吸收带表明Co掺杂样品发生了蓝移现象，如图2(d)所示[12]。

通过X-射线光电子能谱分析可知，Co-C3N4中C/N为0.706，低于石墨氮化碳理论值（0.75）。Co-C3N4的C1s光谱有三个峰，见图3(a)，分别对应于284.8 eV的C-C峰、286.0 eV的C-N峰和288.1 eV的N=C-N峰[13]，其中，288.1 eV处的主峰为C3N4主链中存在的sp2碳，而284.8 eV处的小峰则归属于吸附在表面或任何sp3石墨化碳上的不定形碳。在N1s光谱图3(b)中发现，样品检测到了3种典型的N形态，具体而言，398.5 eV处的峰归属于三嗪环中的sp2杂化氮（C=N-C）[14]，398.8 eV处峰归属于叔氮（C-(C)3），以及400.9 eV处峰归属于CN骨架中的表面氨基（C-NHx）。如图3(c)所示，804.2 eV和786.3 eV分别为Co2p1/2和Co2p3/2的Co(II)峰值，另外，Co(II)元素在781.7 eV处以Co-N的形式与N原子配位，也证明了Co掺杂成功。

图3 Co-C3N4的XPS图谱。（a）C1s；（b）N1s；（c）Co2p

2.2 纯牛奶样品BPA检测

为了考察所构建的钴掺杂氮化碳传感器电极在食品检测中的适用性，本文将该电极用于纯牛奶BPA检测，结果如表1所示，在巴氏杀菌纯牛奶和超高温瞬时灭菌纯牛奶中均未检出BPA。然后，向牛奶样品中分别加入1.0 μmol/L、10.0 μmol/L、15.0 μmol/L和100.0 μmol/L的BPA标准品，对两种预处理过的纯牛奶样品进行加标回收率检测。结果发现，浓度介于1.0～100.0 μmol/L的BPA加标回收率达到81.86%～98.75%，且相对标准偏差（RSD）仅为3.34%～3.57%。在相同测试环境下，与常规HPLC法相比具有更高的回收率，尤其是在更具实际样品分析价值的低浓度范围（0.0～15.0 μmol/L）。特别地，在BPA内标浓度为1.0 μmol/L的两种牛奶样品中，电化学检测回收率高达98.75%，而HPLC则不能进行有效检测（无任何有效信号，BPA回收率为0.0%）；即使在高BPA浓度样品中（100.0 μmol/L），EC检测法依然保持了与HPLC相近的检测效能。上述结果表明，基于Co-C3N4复合材料的电化学传感器在BPA检测中可靠性更高，有效检测浓度范围更宽，在低浓度区间亦具有有效的检测性能。

表1 在EC和HPLC检测体系中BPA的平均回收率（n=3）

与此同时，由于Co-C3N4电极材料具有较大的比表面积、充足的活性位点和优异的电荷介导，使得BPA的电化学检测灵敏度更高，在巴氏杀菌纯牛奶和超高温瞬时灭菌纯牛奶样品中的BPA检出限分别达到了3.7 nmol/L和4.3 nmol/L（两种空白样品分别连续检测10次，取S/N=3），意味着由Co-C3N4复合活性材料所构建的电化学传感器能够满足牛奶样品实时、快速和高效的微痕量检测需求[8]，同时具有操作简便、成本低廉和维护方便等优势，具有较好的应用潜能。

为了揭示钴掺杂氮化碳电极传感器的电化学检测性能，本文采用线性扫描伏安法（LSV）对所做的加标回收率实验样品进行扫描测试，其条件为：电压扫描范围0～1.0 V、扫描速率0.025 V/s、采样间隔0.001 V、电流灵敏度10-5A/V，以及电解质为0.1 mol/L的Na2SO4。图4是Co-N3N4/GCE修饰电极和不同加标浓度的BPA在0.1 mol/L的Na2SO4中的伏安图[15]，可知各样品在约0.6 V处会出现明显的氧化峰，说明该电极的BPA检测灵敏度较高，且随着BPA浓度的增加，纯水体系和牛奶样品的氧化峰所对应的电流响应值都降低，此外牛奶样品电流趋势基本与纯水系统重合，说明BPA在两介质中的电化学检测信号无明显变化，意味着该传感器抗干扰性强，适用于牛奶样品BPA的检测。

图4 不同BPA浓度标准品的线性扫描伏安图。（a）1.0 μmol/L；（b）10.0 μmol/L；（c）15.0 μmol/L；（d）100.0 μmol/L

3 结论

本文以三聚氰胺和CoCl2·6H2O为原料，通过高温煅烧法成功制备了Co-C3N4复合材料，该材料样品表面有更多小片状结构和孔隙，其Co信号强度是0.14%。Co掺杂提高了C3N4比表面积，且抑制了其热聚合，但其基本框架保持良好，晶体结构没有发生显著变化。与此同时，Co-C3N4/GCE修饰电极传感器在巴氏杀菌纯牛奶和超高温瞬时灭菌纯牛奶的BPA加标回收率为81.86%～98.75%，且RSDs为3.34%～3.57%。与常规HPLC 法相比，在低浓度范围内（0.0～15.0 μmol/L）具有更高的回收率和灵敏度，BPA 检出限可达3.7 nmol/L，抗干扰性强，说明钴掺杂氮化碳传感器适用于牛奶样品BPA的电化学检测。