SRSF6和miR-506-3p在结核性胸膜炎胸腔积液中表达的意义及其诊断价值

梁亚充 王国卫 马丽 池跃朋 王智慧 谢兰品 董雅坤 李晓倩

结核性胸膜炎是由于结核分枝杆菌及其代谢产物入侵胸腔侵犯胸膜引发的一种炎症反应[1-2]，胸腔积液是渗出性胸膜炎主要表现[3]。结核性胸膜炎起病较为隐匿，临床容易出现漏诊误诊，因此寻找特异性的诊断指标意义重大。富含丝氨酸/精氨酸剪接因子(Serine/arginine-rich splicingfactor，SRSF)家族已被证实在多种癌症中呈现出异常表达[4]。研究表明，SRSF6在结核性胸腔积液中表达异常升高，敲低SRSF6能够抑制炎症刺激的胸膜间皮细胞的细胞增殖[5]。微小RNAs(microRNAs，miRNAs)参与多种疾病的病理生理过程。Liang[5]等人研究发现，结核性胸腔积液外泌体miR-506-3p表达水平降低，同时抑制miR-506-3p能够促进SRSF6的表达。基于此，本研究对结核性胸膜炎胸腔积液中SRSF6、miR-506-3p进行检测，以探讨两者对结核性胸膜炎的诊断价值。

资料与方法

一、一般资料

选取2020年1月到2022年1月本院收治的60例结核性胸膜炎胸腔积液患者作为结核组，患者均通过胸腔积液的常规检查及胸膜活检确诊。纳入标准：符合《肺结核诊断WS288—2017》中结核性胸膜炎相关诊断标准[6]：①胸腔积液为渗出液，胸腔积液或胸膜组织活检显示结核分枝杆菌阳性；②胸膜组织活检显示典型的结核性病理改变。以上两条满足其中一条即可确诊。另选取同期非结核性胸膜炎胸腔积液患者30例作为对照组。排除标准：①其它原因如恶性肿瘤、肺癌等导致的恶性胸腔积液患者；②免疫性疾病导致的胸腔积液患者；③不接受穿刺患者；④近三个月内有胸部手术史患者；⑤精神异常无法配合患者。两组患者对本研究知情并签署知情同意书。本研究经医院伦理委员会批准，伦理批号：2019-M172。

二、方法

1 临床资料收集

收集患者入院时的基本资料，包括性别、年龄、体质量指数、饮酒史、吸烟史、临床表现(发热、胸痛、咳嗽、气短)。患者住院后，经超声定位引导，无菌条件下进行胸腔穿刺，收集胸腔积液，记录胸腔积液体积，对胸腔积液进行常规检查，包括腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase，ADA)、乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase，LDH)、γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)、淋巴细胞计数、总蛋白等。

2 样品采集

两组患者均于无菌条件下进行胸腔穿刺，抽取胸腔积液约20mL，置含肝素的离心管中，离心机3000r/min离心10min，取上清液，置-80℃冰箱保存待测。

3 主要仪器与试剂

TRIzol试剂(货号：GMS12279)购自上海杰美基因医药科技有限公司；M-MLV反转录试剂盒(货号：RE0510-100T)购自定州百克赛斯生物科技有限公司；荧光定量PCR试剂盒(货号：QPG-050～QPG-052)购自上海吉玛制药技术有限公司；qRT-PCR仪(型号：CFX384)购自美国Bio-Rad公司；SRSF6 ELISA试剂盒(货号：EH2136)购自武汉菲恩生物科技有限公司；SpectraMax iD5型酶标仪购自美谷分子仪器(上海)有限公司。

4 qRT-PCR检测胸腔积液上清液miR-506-3p的表达水平

使用TRIzol试剂提取胸腔积液上清液样本中总RNA，反转录成cDNA(反转录反应体系：总RNA 2 μL、RNase Free dH2O(20 μL)、PrimeScript RT Master Mix(4 μL))后进行qRT-PCR反应，qRT-PCR检测条件：95℃预变性5min循环1次，95℃变性30s、55℃退火45s，75℃延伸15秒，共循环35次。以U6为内源对照，以2-ΔΔCt的方法计算miR-506-3p的表达水平。引物由亚泰恒信生物科技(北京)有限公司合成(见表1)。

5 ELISA法检测胸腔积液SRSF6表达水平

采用ELISA法检测胸腔积液SRSF6水平，操作步骤按照ELISA试剂盒说明书进行。

三、统计学分析

表1 qRT-PCR引物序列

结 果

一、两组临床资料比较

两组年龄、性别、体质量指数、胸腔积液体积、发热、胸痛、咳嗽、气短、饮酒史、吸烟史比较无显著差异(P>0.05)；结核组ADA、LDH、IFN-γ、淋巴细胞计数、总蛋白均明显高于对照组(P<0.05)(见表2)。

表2 两组临床资料比较

二、两组胸腔积液SRSF6、miR-506-3p表达水平比较

结核组胸腔积液SRSF6水平明显高于对照组(P<0.05)，miR-506-3p明显低于对照组(P<0.05)(见表3)。

三、结核组胸腔积液SRSF6与miR-506-3p表达水平的相关性分析

TargetScanHuman网址预测SRSF6与miR-506-3p间存在结合位点(见图1)。Pearson相关性分析结果显示，结核组患者胸腔积液SRSF6与miR-506-3p表达水平呈负相关(r=-0.554，P<0.05)(见图2)。

四、多因素Logistic回归分析影响结核性胸膜炎发生的因素

以发生结核性胸膜炎为因变量(是=1，否=0)，ADA(≥47.57U/L=1，<47.57U/L=0)、LDH(≥361.84U/L=1，<361.84U/L=0)、IFN-γ(≥182.35ng/L=1，<182.35ng/L=0)、淋巴细胞计数(≥5.10×109/L=1，<5.10×109/L=0)、总蛋白(≥43.31g/L=1，<43.31g/L=0)、SRSF6(≥1.57ng/mL=1，<1.57ng/mL=0)、miR-506-3p(<0.75=1，≥0.75=0)为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，SRSF6高水平(≥1.57ng/mL)、miR-506-3p低水平(<0.75)是影响结核性胸膜炎发生的危险因素(P<0.05)(见表4)。

图1 SRSF6与miR-506-3p结合位点

表3 两组胸腔积液SRSF6、miR-506-3p表达水平比较

图2 结核组患者胸腔积液SRSF6与miR-506-3p相关性

五、胸腔积液SRSF6、miR-506-3p表达水平对结核性胸膜炎的诊断价值分析

ROC曲线显示，SRSF6单独诊断结核性胸膜炎的AUC为0.890(95%CI:0.823～0.957)，其敏感度、特异性分别为81.7%、90.0%，截断值为1.205ng/mL；miR-506-3p单独诊断结核性胸膜炎的AUC为0.870(95%CI:0.792～0.949)，其敏感度、特异性分别为76.7%、80.0%，截断值为0.889；两者联合诊断结核性胸膜炎的AUC为0.967(95%CI:0.937～0.996)，其敏感度、特异性分别为85.0%、71.6%，两者联合诊断的AUC显著大于SRSF6单独诊断的AUC(Z=2.072，P=0.038)，miR-506-3p单独诊断的AUC(Z=2.271，P=0.023)(见图3)。

表4 多因素Logistics回归分析影响结核性胸膜炎发生的因素

图3 胸腔积液SRSF6、miR-506-3p诊断结核性胸膜炎的ROC曲线

讨 论

结核病是一种全球性的传染性疾病，中国的结核病负担高居世界第二位[7]。结核性胸膜炎是肺外结核的一种类型，患者常伴有发热、胸痛、咳嗽、气短等不适，并出现不同程度的胸腔积液[8]。胸腔积液可由多种病因引起，如多种恶性肿瘤和一些良性炎症性疾病[9]，而结核性胸膜炎引起的胸腔积液占30%～60%[10]。由于结核性胸膜炎胸腔积液中结核分枝杆菌数量较少，临床检查胸腔积液中结核分枝杆菌难度较大，难以满足诊断要求[8]。目前对于结核性胸膜炎的诊断包含细菌学、分子生物学、病理学、免疫学等多个学科，ADA、LDH、γ干扰素释放试验及聚合酶链反应等发挥了重要作用[11]。不断寻求新的生物标志物和治疗靶点在结核性胸膜炎的治疗中尤为重要。

SRSF家族主要参与基因的剪切调节，研究证实，SRSF家族参与多种疾病的进展[4,12-13]。人SRSF6基因位于第20号染色体上，至少包含7个外显子和6个内含子[14]。SRSF6在急性淋巴细胞白血病[15]、结直肠癌[16]等多种疾病中均呈现出过表达的现象。本研究发现，结核组患者胸腔积液中SRSF6表达水平明显升高，与其在淋巴细胞白血病[15]、结直肠癌[16]中的表达一致，在疾病进展过程中发挥促进作用。同时Han[17]等人研究发现，SRSF家族的其它三种剪接因子在结核性胸腔积液中也呈现出表达升高的现象。由此推测SRSF6能够促进结核性胸膜炎的发生发展，可能与结核性胸膜炎的发病机制存在一定的关联。miRNAs能够与靶mRNA的3′-UTR结合从而调控基因的表达，参与多项生理过程。阳慧[18]等人发现，miR-506-3p能够抑制心肌炎模型大鼠的炎性反应和心肌细胞凋亡。体外细胞实验表明，miR-506-3p能够通过靶向IQGAP1基因抑制甲状腺癌细胞的增殖和迁移[19]。同时miR-506-3p也可接受lncRNA HOXA11-AS的靶向负调控，抑制食管癌细胞的增殖，诱导癌细胞凋亡[20]。本研究中，结核组患者胸腔积液中miR-506-3p表达水平明显降低，表明与其在癌症中的肿瘤抑制作用一样，miR-506-3p对结核性胸膜炎同样具有抑制作用。通过TargetScanHuman网站分析显示，SRSF6与miR-506-3p存在靶向结合位点，表明SRSF6极有可能是miR-506-3p的靶基因。Pearson相关性分析结果显示，结核组患者胸腔积液SRSF6与miR-506-3p表达水平呈负相关，提示miR-506-3p可能通过负向调控SRSF6参与结核性胸膜炎的发生发展。本研究中，在两组患者入院后对其胸腔积液进行了生化检查，发现结核组患者胸腔积液中ADA、LDH、IFN-γ、淋巴细胞计数、总蛋白均明显高于对照组，但多因素Logistic回归分析显示，ADA、LDH、IFN-γ、淋巴细胞计数、总蛋白不是影响结核性胸膜炎发生的危险因素，可能是由于这些指标容易受到患者的年龄、淋巴细胞数量、结核分枝杆菌的细菌负荷等因素的影响，但依然可作为诊断的参考项目。多因素Logistic回归分析显示，SRSF6高水平、miR-506-3p低水平是影响结核性胸膜炎发生的危险因素，表明两者在结核性胸膜炎的疾病进展中发挥着重要作用。同时ROC曲线显示，胸腔积液SRSF6、miR-506-3p诊断结核性胸膜炎的AUC分别为0.890、0.870，两者联合诊断的AUC为0.967，且敏感度高于两者单独诊断。表明胸腔积液SRSF6、miR-506-3p对结核性胸膜炎有一定的诊断价值，且两者联合的诊断价值更高。

综上所述，结核性胸膜炎患者胸腔积液SRSF6表达升高，miR-506-3p表达降低，两者可能参与结核性胸膜炎的疾病进展过程，是影响结核性胸膜炎的危险因素，两者联合对结核性胸膜炎具有更高的诊断价值，有望成为早期诊断指标。但本研究纳入病例数较少，同时并未深入探讨两者在结核性胸膜炎中的具体作用机制，因此后续仍需进行深入研究。