益肾疏肝汤对卵巢储备功能减退模型大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响

肖潇 ，刘艳霞 ，危一飞 ，邢玉 ，刘君 ，滕秀香

1.北京中医药大学第二临床医学院，北京 100078； 2.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；3.北京中医药大学东方医院，北京 100078； 4.中国中医科学院望京医院，北京 100102

卵巢储备功能减退（diminished ovarian reserve，DOR）是指卵巢中卵母细胞数目减少或质量下降，引起女性生殖功能减退[1]，同时伴有抗米勒管激素（AMH）水平降低、窦卵泡数目减少、促卵泡素（FSH）水平升高[2]。DOR发病率约10%～35%[3]，临床常表现为生育能力降低、月经紊乱、性激素缺乏或波动相关症状[4-5]。DOR发病机制尚不完全明确，目前普遍认为，多种因素引起的卵巢颗粒细胞过度凋亡，卵泡闭锁加速，卵母细胞数量及质量下降是DOR重要发病机制。国内外对于DOR尚无确切有效的治疗方法，对有生育需求的患者，建议积极试孕或辅助生殖技术[6-7]。临床常采用性激素治疗模拟女性正常生理周期，提高患者的生活质量，改善其临床症状，但禁忌证及慎用情况较多，对卵巢储备及生育力改善效果不明显[8]。

中医药治疗DOR具有一定优势，可以多系统、多靶点调控性腺轴，改善激素水平，缓解临床症状，保护卵巢功能[9-10]。滕秀香教授传承国医大师柴嵩岩学术思想，结合多年临床经验，提出肾虚肝郁证为DOR的主要病机[11]，应用补肾疏肝法治疗。益肾疏肝汤为首都医科大学附属北京中医医院治疗DOR的协定处方。前期研究发现，益肾疏肝汤治疗肾虚肝郁型DOR，不仅能改善患者临床症状，还能改善卵巢储备功能，调节性激素水平[12]。因此，为进一步探讨益肾疏肝汤治疗DOR的作用机制，本研究采用雷公藤多苷制备DOR大鼠模型，观察大鼠动情周期、性腺指数、卵巢组织形态变化，并检测血清性激素水平、卵巢颗粒细胞凋亡及卵巢组织凋亡蛋白表达，探讨其治疗DOR的分子机制，为临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级健康雌性SD大鼠32只，12周龄，体质量（180±20）g，购于中国食品药品检定研究院，动物许可证号SCXK（京）2017-005。饲养于中国中医科学院实验动物中心标准动物房，自由摄食饮水。本实验由首都医科大学附属北京中医医院动物伦理委员会审查批准（2022-05-08）。

1.2 药物及制备

益肾疏肝汤（女贞子15 g，熟地黄10 g，墨旱莲15 g，北沙参20 g，石斛10 g，续断15 g，桑寄生15 g，菟丝子15 g，酒白芍10 g，月季花6 g，柴胡5 g，白梅花10 g，丹参10 g，桃仁10 g，瞿麦6 g，葛根6 g，甘草6 g），饮片购于首都医科大学附属北京中医医院。上述饮片按常规方法水煎、浓缩，配制成浓度分别为1.92、3.83 g/mL益肾疏肝汤药液。雷公藤多苷片，上海复旦复华药业有限公司，10 mg/片，批号210102，用蒸馏水配成浓度为5 mg/mL混悬液。

1.3 主要试剂与仪器

FSH检测试剂盒（货号H101-1-1），南京建成生物工程研究所；雌二醇（E2）检测试剂盒（货号CEA461Ge）、AMH检测试剂盒（货号CEA228Ra），武汉云克隆科技股份有限公司；HE染色试剂盒（货号G1120），北京索莱宝科技有限公司；一步法TUNEL细胞凋亡试剂盒（货号C1089），碧云天生物技术有限公司；Bcl-2抗体（货号Sc-492），美国Santa Cruz公司；Bax抗体（货号50599-2-IG），美国Proteintech公司；Caspase-3抗体（货号ab4051），英国Abcam；GAPDH抗体（货号AB-P-R 001），杭州贤至生物科技有限公司。共聚焦显微镜（型号LSM 780，德国Zeiss），台式玻片扫描机（型号Aperio CS2，德国Leica），Western blot电泳系统（美国Bio-Rad公司），高速冷冻离心机（型号FRESCO 21，美国 Thermo Fisher公司），水平脱色摇床（型号WD-9405C，北京六一仪器）。

2 实验方法

2.1 分组及造模

32只大鼠适应性喂养7 d，采用随机数字表法分成空白组8只、造模组24只，空白组不予处理，造模组予雷公藤多苷片混悬液50 mg/kg灌胃14 d，每日1次[13-14]。造模结束后次日观察大鼠阴道涂片，出现某一周期时间延长，周期紊乱表现，表明造模成功。将24只成模大鼠再随机分为模型组和中药低、高剂量组，每组8只，造模成功后次日开始给药，根据人和动物体表面积折算的等效剂量计算，中药低剂量组予益肾疏肝汤16.38 g/kg（相当于临床等效剂量）灌胃，中药高剂量组予益肾疏肝汤32.76 g/kg（相当于临床等效剂量2倍）灌胃，空白组和模型组予生理盐水3 mL灌胃，每日1次，连续15 d。

2.2 取材

给药结束后，0.3%戊巴比妥钠10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉采血2 mL，室温静置30 min，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清液，于-20 ℃冰箱保存备用。颈椎脱臼处死大鼠，无菌条件下取出子宫、卵巢并称重，一侧卵巢置于10%中性甲醛溶液中浸泡，另一侧卵巢放于-80 ℃冰箱备用。

2.3 指标检测

2.3.1 动情周期

每日上午9:00用细棉签蘸取生理盐水，于大鼠阴道内轻轻旋转2圈，行阴道涂片，涂片风干后30 min，置于苏木素染料中浸泡3 min，流水冲洗5 s，1%盐酸酒精溶液分化10 s，流水轻轻冲洗5 s，放入伊红染料中浸泡1 min，水洗5 s。显微镜下观察阴道脱落细胞的种类和形态，判断大鼠动情周期。分别记录大鼠造模期和给药期动情次数。

2.3.2 性腺指数

根据大鼠子宫、卵巢湿重及末次称量体质量计算卵巢指数和子宫指数。卵巢指数=双侧卵巢湿重÷体质量；子宫指数=子宫湿重÷体质量。

2.3.3 血清性激素水平

采用ELISA检测血清AMH、FSH、E2含量，严格按试剂盒说明书操作。

2.3.4 卵巢形态观察

卵巢用10%中性甲醛固定24 h，石蜡包埋，制成5 μm切片，HE染色后，显微镜下观察卵巢形态、各级卵泡数目，采用ImageScope软件记录。

2.3.5 卵巢颗粒细胞凋亡率

各组随机选取3只大鼠卵巢组织蜡块，切片（厚度5 μm），TUNEL法检测卵巢颗粒细胞凋亡情况，严格按试剂盒说明书操作。以细胞核出现红色颗粒为阳性细胞，每张切片随机选取3个视野，采用Image J 1.8.0软件计算颗粒细胞凋亡率（阳性细胞数÷细胞总数×100%）。

2.3.6 Western blot检测

加入RIPA裂解液提取卵巢组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度，蛋白浓度调整为2 μg/μL，上样，凝胶电泳，转膜，封闭，加入Bax、Caspase-3、Bcl-2一抗（均为1∶1 000），4 ℃水平摇床孵育过夜，TBST洗膜10 min×3次，加二抗，室温孵育60 min，TBST洗膜10 min×3次，化学发光，显影成像，以GAPDH为内参，应用Image J 1.8.0软件对条带进行灰度分析。

3 统计学方法

4 结果

实验过程中各组大鼠均无死亡。空白组大鼠状态良好，被毛光滑，饮食正常；模型组大鼠精神状态差，被毛稀松，饮食减少；中药低、高剂量组大鼠上述表现较模型组有所改善，精神状态转佳，被毛逐渐光滑，饮食增加。

4.1 益肾疏肝汤对模型大鼠动情周期的影响

造模结束后，与空白组比较，造模大鼠动情次数明显减少（P<0.01）。给药结束后，与空白组比较，模型组大鼠动情次数明显减少（P<0.01）；与模型组比较，中药低、高剂量组大鼠动情次数明显增加（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠动情次数比较（±s，次）

表1 各组大鼠动情次数比较（±s，次）

注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

组别空白组模型组中药低剂量组中药高剂量组只数8 8 8 8造模期2.87±0.33 1.38±0.48**1.50±0.50**1.38±0.69**给药期2.87±0.33 1.50±0.50**2.13±0.50#2.25±0.71#

4.2 益肾疏肝汤对模型大鼠性腺指数的影响

与空白组比较，模型组大鼠卵巢指数、子宫指数明显降低（P<0.01）；与模型组比较，中药低、高剂量组大鼠卵巢指数、子宫指数明显升高（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠性腺指数比较（±s，mg/g）

表2 各组大鼠性腺指数比较（±s，mg/g）

注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

组别空白组模型组中药低剂量组中药高剂量组只数8 8 8 8卵巢指数0.59±0.05 0.52±0.08**0.57±0.01#0.58±0.01#子宫指数2.23±0.15 1.93±0.27**2.26±0.32#2.32±0.30#

4.3 益肾疏肝汤对模型大鼠血清性激素含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清AMH、E2含量明显减少（P<0.01），FSH含量明显增加（P<0.01）；与模型组比较，中药低、高剂量组大鼠血清AMH、E2含量明显增加（P<0.01），FSH含量明显减少（P<0.01）；与中药低剂量组比较，中药高剂量组大鼠血清AMH、E2含量明显增加（P<0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清AMH、FSH、E2含量比较（±s）

表3 各组大鼠血清AMH、FSH、E2含量比较（±s）

注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01；与中药低剂量组比较，△P<0.05

组别空白组模型组中药低剂量组中药高剂量组只数8 8 8 8 AMH/（pg/mL）0.43±0.02 0.31±0.02**0.36±0.01##0.38±0.01##△FSH/（mIU/mL）0.35±0.04 0.60±0.15**0.42±0.01##0.40±0.00##E2/（pg/mL）1.05±0.05 0.82±0.04**0.93±0.02##0.97±0.02##△

4.4 益肾疏肝汤对模型大鼠卵巢组织形态的影响

空白组大鼠卵巢结构清晰，各级卵泡发育良好，成熟卵泡中颗粒细胞层次多、卵泡液多，可见完整的卵母细胞，卵巢间质未见明显炎症细胞浸润及纤维化；模型组大鼠卵巢结构明显紊乱，各级卵泡数目均明显减少，闭锁卵泡数目增多，未见成熟卵泡，卵泡中颗粒细胞层次减少、排列紊乱疏松，卵巢间质可见大量炎症细胞浸润及纤维化；中药低剂量组大鼠卵巢组织病理形态较模型组有所改善，各级卵泡及成熟卵泡数目增加、卵泡液含量增多，仍可见部分闭锁卵泡，卵巢间质可见少量炎症细胞浸润及纤维化；中药高剂量组大鼠卵巢组织病理形态明显改善，仅见少量闭锁卵泡，各级卵泡及成熟卵泡数目明显增加，颗粒细胞层次增多、卵泡液含量增多。见图1。

图1 各组大鼠卵巢组织形态（HE染色，×100）

4.5 益肾疏肝汤对模型大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响

与空白组比较，模型组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率明显升高（P<0.01）；与模型组比较，中药低、高剂量组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率明显降低（P<0.05），中药高剂量组明显优于中药低剂量组，差异有统计学意义（P<0.01）。见图2、表4。

表4 各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率比较（±s，%）

表4 各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率比较（±s，%）

注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05；与中药低剂量组比较，△△P<0.01

组别空白组模型组中药低剂量组中药高剂量组只数3 3 3 3凋亡率4.0± 3.1 74.6±11.3**41.2±12.2#11.3± 8.9#△△

图2 各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡阳性表达（TUNEL染色，×200）

4.6 益肾疏肝汤对模型大鼠卵巢组织Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠卵巢组织Bax、Caspase-3蛋白表达明显升高（P<0.01），Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显降低（P<0.01）；与模型组比较，中药低、高剂量组大鼠卵巢组织Bax、Caspase-3蛋白表达明显降低（P<0.05，P<0.01），Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显升高（P<0.05，P<0.01）。见图3、表5。

图3 各组大鼠卵巢组织Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白免疫印迹

表5 各组大鼠卵巢组织Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达比较（±s）

表5 各组大鼠卵巢组织Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达比较（±s）

注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

组别空白组模型组中药低剂量组中药高剂量组只数6 6 6 6 Bcl-2 0.93±0.20 0.60±0.08**0.82±0.15#0.85±0.15#Bax 0.53±0.17 1.12±0.31**0.82±0.25#0.82±0.24#Bcl-2/Bax 1.85±0.44 0.56±0.13**1.07±0.26##1.09±0.17##Caspase-3 0.59±0.09 1.00±0.17**0.77±0.14##0.70±0.10##

5 讨论

DOR近年来有年轻化的趋势。随着生育年龄逐渐后移，卵巢功能及生育能力减退严重影响女性的生殖及身心健康。因此，早发现、早干预对保护女性卵巢储备功能及生育能力有重要意义。临床常用的激素替代疗法治疗DOR可有效恢复月经周期、调整激素代谢水平、改善临床症状，但很难恢复患者的卵巢储备功能。

肾虚肝郁为DOR的常见证型[15]，补肾填冲、疏肝养血为其常用治法。补肾疏肝类中药治疗DOR在改善激素水平、提高AMH及窦卵泡数目方面与西药相当，但不良反应少[16]。益肾疏肝汤以女贞子、熟地黄相须为君药，入肝、肾二经，滋阴补血同时填充冲脉血海；北沙参、墨旱莲、石斛、续断、菟丝子、桑寄生为臣药，补益肝肾、滋阴清热；酒白芍、月季花、柴胡、白梅花养血柔肝、疏肝解郁，丹参、桃仁活血调经，瞿麦、葛根退热生津，以上共为佐药；甘草为使，调和诸药。该方补肾疏肝同时养血柔肝、退热生津以护阴液，滋阴而不壅滞，疏肝而不辛燥，达改善卵巢功能之效。研究表明，方中女贞子、墨旱莲、续断、熟地黄、菟丝子等具有调节血清性激素水平、刺激卵泡生长、增加子宫腺体指数、保护卵巢功能作用[17-20]。颗粒细胞过度凋亡会加速卵巢卵泡闭锁，引起DOR[21-22]，鉴于此，我们推测益肾疏肝汤可能通过调节凋亡相关因子表达→抑制卵巢颗粒细胞凋亡→减少卵泡闭锁→提高卵巢储备功能→治疗DOR，并通过本研究加以验证。

本研究采用雷公藤多苷灌胃制备DOR大鼠模型，结果显示，造模后大鼠精神状态差，被毛逐渐稀松，饮食量减少，并出现动情周期紊乱，性腺指数显著下降。经益肾疏肝汤干预后，大鼠精神状态转佳，被毛逐渐光滑，饮食量增加，动情周期缩短并趋于正常，性腺指数提高。血清性激素水平是直接反映卵巢功能的重要指标，其中FSH水平升高及AMH水平下降为临床诊断DOR的主要指标，E2水平为DOR诊断的重要参考。模型组大鼠血清AMH、E2水平下降，FSH水平升高；中药低、高剂量组大鼠血清AMH、E2水平显著升高，FSH水平显著下降，提示益肾疏肝汤能有效改善DOR大鼠血清性激素水平，对下丘脑-垂体-性腺轴具有一定的调控作用。HE染色结果显示，模型组大鼠卵巢组织各级卵泡数目明显减少，有大量卵泡闭锁；与模型组相比，益肾疏肝汤可有效恢复模型大鼠卵巢结构，促进各级卵泡发育，减少卵泡异常闭锁，减少炎症细胞浸润及纤维化，且中药高剂量组效果更明显。

目前认为，卵巢颗粒细胞过度凋亡是引起卵巢功能下降的主要原因。卵泡颗粒细胞处于凋亡状态和层数减少也作为DOR造模成功的重要依据[23]，强调了颗粒细胞凋亡是DOR重要的发病机制。Bcl-2蛋白家族介导的线粒体内源凋亡通路在卵巢颗粒细胞凋亡过程中占主导地位，Bcl-2/Bax比值被称为细胞的“凋亡开关”，影响卵泡发育或闭锁。Caspase是细胞凋亡的关键效应酶，多条凋亡信号通路均需Caspase-3介导。Bcl-2/Bax比值降低后引起Caspase级联反应，诱导卵巢颗粒细胞凋亡[24]，而纠正相关凋亡蛋白表达可抑制颗粒细胞凋亡，一定程度恢复卵巢功能[22]。本实验结果显示，模型组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率明显升高，卵巢组织Bcl-2蛋白表达降低，Bax、Caspase-3蛋白表达升高，同时Bcl-2/Bax比值降低；经益肾疏肝汤干预后，卵巢颗粒细胞凋亡率明显降低，卵巢组织Bcl-2蛋白表达升高，Bax、Caspase-3蛋白表达降低，Bcl-2/Bax比值升高，提示益肾疏肝汤可能通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2、下调促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达，逆转卵巢颗粒细胞凋亡情况。

综上，益肾疏肝汤可恢复DOR模型大鼠动情周期，提高性腺指数，减少卵泡闭锁，调节血清性激素水平，从而改善DOR大鼠病理状态，提高卵巢储备功能，其机制与抑制卵巢颗粒细胞凋亡有关。本研究存在一定局限性，包括样本量偏小、未使用在定位方面更具优势的免疫组化方法评估Bcl-2、Bax等蛋白表达，未使用RT-PCR检测基因变化，未在信号通路层面探究益肾疏肝汤治疗DOR的机制等，今后将进一步完善。

备注：肖潇，北京中医药大学以同等学力申请博士学位在职人员。