牛无绿藻乳腺炎的研究现状

张海艳，许顺鑫，陈秋慧，李政志，严 蕊，胡秀秀，郭爱珍,3，胡长敏*,陈 洁

(1.武汉市农业科学院畜牧兽医研究所，湖北武汉 430208；2.华中农业大学动物医学院，湖北武汉 430070；3.农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉 430070；4.长江大学动物科学学院，湖北荆州 434025)

牛无绿藻(Protothecabovis)是一种不含叶绿素的藻类，普遍存在于环境和动物肠道中[1]。牛无绿藻乳腺炎在波兰、韩国等14个奶牛养殖业高度发达的国家(地区)相继报道[2-3]。2011年，我国首次报道了牛无绿藻临床型乳房炎暴发，Gao J等[4]在牛无绿藻乳腺炎的病例报道中，牛无绿藻分离率为10%～39%。

牛无绿藻乳腺炎不仅导致奶牛产奶量下降，而且使奶品质降低。奶牛分泌含有白色薄片的稀水样牛奶，治疗不及时导致牛乳腺坏死以及奶牛过早淘汰。据报道牛无绿藻乳腺炎的临床症状通常不明显，呈亚临床或慢性经过[2,4-5]。牛无绿藻属于藻类，有效抗菌药物少，治疗较为困难。牛无绿藻可以感染人。病例报告显示，它可以感染人的脑部、关节，造成慢性脑膜炎、关节炎，甚至能导致人的肺炎和发热性白细胞减少症[6-7]。现阶段国内外关于牛无绿藻的研究较少，论文拟从牛无绿藻乳腺炎的病原学、流行病学、发病机制、诊断及治疗等方面对牛无绿藻乳腺炎进行综述，为牛无绿藻的后续研究提供借鉴。

1 病原学

牛无绿藻在显微镜下呈椭圆形，有一层细胞壁，孢子囊直径约为7 μm～30 μm。它不含叶绿素，营寄生生活，通过形成孢子囊孢子进行无性繁殖，可以分解丙酮酸，利用二羧酸，适宜培养温度为25 ℃～30 ℃，培养过程中需要氧气。牛无绿藻对高温有极强的抵抗力，对40株牛无绿藻使用巴氏杀菌法维持20 s后，有13.5%的菌株存活，且进入牛的消化系统后仍能存活。根据文献资料，牛无绿藻不仅在干奶期乳房存活，且可与其他微生物共同感染乳腺[5]。

2 流行病学

牛无绿藻乳腺炎在夏季多雨高温时期多发，牛舍及牛床为重要的传染源。在波兰，它是牛乳腺炎的第三大病原[3]。在波兰16个奶牛场中400头奶牛及其周围环境1 211份样本中发现牛无绿藻，是最常见的病原，仅次于链球菌和葡萄球菌。另据报道，牛无绿藻乳腺炎的总患病率为8.3%，75.8%的病例具有亚临床病程[8]，且通常感染分娩后的奶牛。弄清牛无绿藻乳腺炎的流行病学情况，有助于指导牛无绿藻乳腺炎的精准防控。

3 牛无绿藻乳腺炎的发病机制

3.1 牛无绿藻感染直接导致乳腺损伤

研究表明牛无绿藻可侵入乳腺实质，在乳腺中大量复制，引起奶牛急性和慢性乳腺炎。据报道它对奶牛乳房间质和小鼠乳腺腺泡具有破坏作用[9]，过碘酸雪夫染色和六胺银染色法检测到牛无绿藻在哺乳期小鼠乳腺中复制，可观察到牛无绿藻和它内部的圆形或椭圆形孢子囊。Shahid M[9]研究结果显示，牛无绿藻引起乳腺感染，导致乳腺组织不可逆损伤，特征为巨噬细胞、浆细胞和淋巴细胞浸润。另有报道显示，它还可诱发慢性肉芽肿性乳腺炎，致奶牛产奶量明显减少[10-11]。

3.2 牛无绿藻感染诱发炎性细胞因子

牛无绿藻感染小鼠后诱导小鼠巨噬细胞和乳腺上皮细胞中的白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、趋化因子(C-X-C基元)配体1(chemokine (C-X-C motif) ligand 1 protein,Cxcl-1)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表达[9]。牛无绿藻还可以诱导牛乳腺上皮细胞白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8) 信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)表达增加，提示IL-8在牛无绿藻乳腺炎中起重要作用[12]。牛无绿藻感染乳腺不仅导致炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8分泌增加，还可以通过线粒体活性氧(mitochondrial ROS，MtROS)介导核因子(nuclearfactor,NF)-κB、和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain(NOD)-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)炎症小体通路的激活诱导炎症反应[13]。

3.3 牛无绿藻感染诱导乳腺上皮细胞凋亡

研究显示牛无绿藻通过诱导巨噬细胞和乳腺上皮细胞释放IL-1β和TNF-α介导奶牛乳腺上皮细胞凋亡[9]，牛无绿藻可诱导体外培养的奶牛乳腺上皮细胞凋亡[14-15]。Shahid M等[9]在小鼠乳腺炎模型中亦证明牛无绿藻的促凋亡作用，包括促凋亡基因Bax和Apaf-1的增加和抑凋亡基因Bcl-2减少。此外，牛无绿藻通过氧化防御和抗氧化防御的失衡以及诱导细胞内活性氧(ROS)的产生，使得bMECs发生氧化应激和细胞凋亡[16]，触发Bcl-2家族蛋白[17]的促凋亡成分Bax表达。由于牛无绿藻入侵导致线粒体损伤，细胞色素C蛋白从线粒体释放到细胞质中，并与Apaf-1结合，诱发凋亡小体形成，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9(cysteinyl aspartate specific proteinase -9，caspase-9)[18-20]。

4 临床症状及病理变化

牛患急性无绿藻乳腺炎时，体温升高至40 ℃，感染乳区明显增大、疼痛、坚硬或水肿。患牛食欲不振且不愿意运动，产奶量大幅下降甚至完全停止。慢性牛无绿藻乳腺炎的特征为乳腺水肿，疼痛轻微，奶牛产奶量下降，奶呈水样且含有灰色薄片分泌物，部分患牛可见乳腺明显增大，少部分呈纤维化样硬化。在单个乳区病理组织切面上可见大量米粒状乳黄色丘疹，直径约0.5 mm～3 mm，含纤维丝的黏液性不透明黄白色分泌物存在于泌乳窦和乳头窦中。

5 牛无绿藻乳腺炎的诊断

牛无绿藻乳腺炎的临床症状缺乏特异性，在疑似牛无绿藻乳腺炎时，还需进行实验室检查确诊。

5.1 牛无绿藻的分离培养鉴定

取100 μL奶样均匀涂布在无绿藻分离培养基(Protothecaisolation medium，PIM)上，37 ℃培养48 h～72 h之后，可以看到白色或黄白色，边缘光滑而暗淡，中心有小突起菌落，使用乳酸酚棉蓝染色，在油镜下进行镜检。高倍镜可观察到呈球形至椭圆形孢子囊，带有2个～6个孢子囊孢子[21]。

5.2 牛无绿藻的分子生物学检测

5.2.1 基于真核生物核糖体脱氧核糖核酸的检测方法 Jagielski T等[8]2010年开发了无绿藻属基于真核生物核糖体脱氧核糖核酸(ribosomal deoxyribo nucleic acid，rDNA)序列的基因型特异性聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)方法，可区分中型无绿藻的3种不同基因型。Sara等使用Huss设计的保守的真核特异性引物进行PCR扩增，将18S rDNA为模板扩增的PCR片段进行HaeⅢ酶切，得到RP 1和RP 2两种不同的片段，成功区分牛无绿藻与其他无绿藻属的菌株。

5.2.2 基于限制性片段长度多态性的检测方法 研究人员采用基因型特异性PCR和限制性片段长度多态性 (restriction fragment length polymorphism,RFLP) 分析方法，对乳腺炎奶样中牛无绿藻分离株与中型无绿藻基因Ⅰ型 (Protothecaciferrii)进行基因分型，使用Kpn21/SmaⅠ限制性内切酶将18S rDNA切割成两个大小不同的片段，从而对上述两种病原进行鉴别。Marques S等[22]建立了一种基于核糖体DNA内部转录间隔区 (internal transcribed spacer，ITS) 序列的方法，成功应用于牛乳汁中P.bovis和P.blaschkeae鉴定。

5.2.3 多重聚合酶链反应检测 Capra等用无绿藻属分离株的线粒体和叶绿体部分序列特异扩增的新靶点，建立了两种多重PCR的方法，可用于同时检测牛无绿藻、P.blaschkeae和魏氏无绿藻(Protothecawickerhamii)菌株[23]。Morandi S等[24]采用3条引物(M13、OPA-4、OPA-18)对牛无绿藻进行多重PCR和单链构象多态性分析，后使用随机扩增多态性DNA进行鉴定。

5.2.4 荧光定量聚合酶链反应方法 Masanobu等设计牛无绿藻的特异性引物18PZF1和18PZR1，以及TaqMan探针PZP1，使用ResoLight染料分析扩增产物的熔融曲线可以区分P.ciferri和P.bovis，建立了用于检测和鉴定牛无绿藻的特异性定量PCR体系，并开展28株培养菌株和140株临床菌株的特异性检测[25]。Romana B等[26]研发了一种多重实时荧光定量PCR系统，可快速和准确定量无绿藻属，并对P.blashkeae、P.ciferrii及牛无绿藻进行鉴别检测。使用快速和高通量的两步Qpcr/RMA分析工具，可有效地用于鉴定牛无绿藻、P.wickerhamii及P.blaschkeae。

高分辨率熔解实时荧光定量PCR技术，即用18S rDNA引物对提取牛无绿藻的DNA进行PCR扩增，并且在PCR体系加入ResoLight荧光染料，再将PCR产物直接放入高分辨率熔解分析仪中，根据不同的熔解曲线对原18S rDNA结构域进行分析，可以在3 h内区分P.ciferrii和P.bovis，较传统序列分析极大缩短了时间[27]。

6 牛无绿藻乳腺炎的防治

6.1 牛无绿藻乳腺炎的预防

6.1.1 环境消毒 鉴于环境中牛无绿藻大量存在，环境消毒对预防牛无绿藻乳腺炎意义重大。高可溶性聚吡咯(polypyrrole，Ppy) 是已知的抗菌活性分子，用不同浓度的Ppy处理牛无绿藻菌株，并在扫描电镜下观察其形态变化，结果发现15.625 μg/mL ～ 62.5 μg/mL的Ppy对牛无绿藻菌株有杀灭作用[28]。氯己定和聚维酮碘对牛无绿藻也有较好的杀菌效果，氯己定和聚维酮碘对16株牛无绿藻的最低杀藻浓度(minimal algaecide concentrations，MAC) 分别为1.56 μg/mL ～3.13 μg/mL和48.83 μg/mL ～390.63 μg/mL[29]。另外有研究表明，牛无绿藻菌对低浓度胍敏感，说明胍可用作挤奶设备的消毒剂[30]。此外，蓝光照射也有杀藻效果[31]。

6.1.2 使用中药 研究显示，部分中药具有较好的杀菌抗炎效果，在奶牛泌乳期定期添加部分中药可提高奶牛免疫力，本实验室使用中药制剂治疗奶牛无绿藻乳腺炎取得了显著成效[32]。中草药可以有效避免使用抗生素带来的药物残留，但由于中药成分复杂，提取活性成分的过程较繁琐，因此现阶段牛场使用中药防治牛无绿藻乳腺炎的普及率不高，随着养殖端禁抗政策实施，应用中药防控奶牛乳腺炎仍有较好前景。

6.1.3 饲养管理 强化饲养管理，保证每日摄入的营养均衡，又防止过度饲喂导致营养过剩。保证饮水安全及饲料新鲜，定期检查饲料是否霉变，及时更换清理垫料。定期对牛舍进行消毒，挤奶前使用浸润过消毒液的毛巾进行乳区消毒，每头奶牛使用完挤奶设备后均需消毒一次，并及时清理牛舍中的粪污和其他污染物。

6.2 牛无绿藻乳腺炎的治疗

早诊断、早治疗是高效防控牛无绿藻乳腺炎的关键，牛无绿藻对两性霉素B和制霉菌素，以及伊曲康唑、泊沙康唑和雷乌康唑敏感[33]。研究人员对我国3个省的620头奶牛及其周围环境中分离出的84株牛无绿藻进行了药敏试验，结果显示牛无绿藻对阿米卡星敏感性较高，其次是两性霉素B和制霉菌素[34]。内源性抗菌肽是乳腺天然防御牛无绿藻的关键，而人抗菌肽LL-37具有杀藻和免疫调节功能[35]。

7 展望

牛无绿藻可以导致牛的急性或慢性乳腺炎，引起牛产奶量减少，给全球奶业带来巨大经济损失。目前对于牛无绿藻的研究大多集中在分子生物学检测方面，对于单一牛无绿藻的感染以及与其他病原菌的共感染机制均不清楚，且目前尚未开发出应用于牛无绿藻乳腺炎早期现场诊断的方法。因此，探寻牛无绿藻乳腺炎精准诊断技术及高效防控药物，将助力牛无绿藻乳腺炎的科学高效防控。