先天性干扰素免疫缺陷致遗传性分枝杆菌易感综合征的机制研究

涂小娇 刘亭亭 刘 红 张福仁

山东第一医科大学附属皮肤病医院(山东省皮肤病医院),山东省皮肤病性病防治研究所,济南,250022

γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)主要由自然杀伤细胞(natural killer cells, NK细胞)和活化的T细胞(Th1以及CD8+T细胞)产生,作为驱动免疫防御的关键角色,在先天性和适应性免疫中都发挥着重要作用。鉴于其在免疫系统中的重要功能,IFN-γ免疫缺陷可以导致许多疾病的发生,如遗传性分枝杆菌易感综合征(mendelian susceptibility to mycobacterial disease, MSMD)［1］。MSMD是一种罕见的遗传性疾病,患者易对卡介苗(BCG Vaccine)和环境分枝杆菌等弱毒力分枝杆菌选择性易感。本文回顾了目前已发现的MSMD患者致病突变及介导的IFN-γ免疫缺陷,这些MSMD患者大多是幼年发病,一般表现为播散性分枝杆菌感染,少数患者有鸟分枝杆菌感染或伴有其他细菌感染,大多数在接种BCG之后发病,可出现长时间发热并伴有强烈的急性期反应,如体重减轻、肝脾肿大、骨损伤等,患者接种BCG部位周围淋巴结可出现肿大伴压痛,淋巴结活检能检测到抗酸杆菌,使用抗分枝杆菌治疗有效,急性期患者由于病情较重可能出现生命危险。同时在所有已知的原发性免疫缺陷或先天性免疫异常中,MSMD表现出最高水平的遗传异质性［2］。自1996年以来,已经报道了18个与MSMD相关的致病基因:IFNG、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL23R、ISG15、TYK2、RORC、IFNGR1、STAT1、CYBB、IFNGR2、JAK1、IRF8、SPPL2A、NEMO、TBX21、ZNFX1。其中IL12RB1和IFNGR1基因突变是MSMD最常见的遗传病因,在目前发现的遗传缺陷病例中约占80%［3］。MSMD相关的基因突变包含多种遗传模式,如常染色体隐性遗传(autosomal recessive, AR)、常染色体显性遗传(autosomal dominant, AD)或X连锁隐性遗传(X-linked recessive, XR)［4-6］。同一基因不同突变也可以表现为不同遗传类型。基因突变会影响其编码的蛋白表达,从而影响其介导的功能［7,8］。虽然致病基因和突变类型存在异质性,但这些遗传变异均可造成先天性IFN-γ免疫缺陷。根据其对IFN-γ介导的免疫功能的影响将这些致病基因分为三种类型:直接引发IFN-γ表达下降的基因如IFNG、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL23R、ISG15、TYK2、RORC;减缓IFN-γ介导的免疫反应的基因如IFNGR1、IFNGR2、JAK1、STAT1、CYBB;同时下调IFN-γ表达及反应的基因如IRF8、SPPL2A、NEMO、TBX21［7,8］。此外近期有研究发现与MSMD相关的新的致病基因ZNFX1,其突变对IFN-γ相关免疫反应及其抗菌免疫机制的影响仍需进一步探索。

1 MSMD的致病基因

1.1 影响IFN-γ表达的基因 基因如IFNG、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL23R、ISG15、TYK2、RORC发生突变后,可直接引发IFN-γ表达下降从而使机体防御弱毒力分枝杆菌能力下降,导致弱毒力分枝杆菌易感。

IFNG基因编码IFN-γ蛋白,Kerner等发现2例MSMD患者携带IFNG纯合突变c.354_357del(p.T119Ifs*4)。研究发现突变会使HEK293T细胞、疱疹病毒感染的患者T细胞(HVS-T细胞)IFN-γ表达缺失,同时患者CD4+、CD8+和γδT细胞分泌的IFN-γ减少［7］。

IL12B基因编码IL-12p40,IL-12p40和IL-12p35共同组成IL-12p70［9,10］,在诱导NK和T淋巴细胞产生IFN-γ中起主要作用［10,11］。Alodayani等［12］发现3例来自沙特阿拉伯的MSMD患者携带IL12B纯合突变 c.G180del(p. W60*)。实验室发现该突变会抑制患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)IL-12p40产生;同时在BCG、IFN-γ刺激下患者PBMC分泌的IL-12p70也减少。此外,多项研究报道了IL12B突变类型存在一定的地域性,如沙特阿拉伯的患者携带 315_316insA/315_316insA［12］,印度/巴基斯坦的患者多携带g.482+83_856-855del,伊朗患者是 c.527_528del,突尼斯患者则是c.298_305del。这些突变均使患者全血细胞分泌的IL-12p40减少,从而导致IFN-γ分泌减少［13］。

IL12RB1基因编码IL-12Rβ1,其与IL-12Rβ2组成IL-12受体复合物。IL-12与IL-12受体复合物结合激活JAK-STAT信号通路促进IFN-γ分泌［14-16］。自1998年起,研究发现了多种与MSMD相关的IL12RB1突变,IL-12Rβ1表达异常使IFN-γ分泌下降是MSMD最常见的遗传病因［14,17-19］。例如,Altare等发现4例MSMD患者在IL12RB1基因发生三种纯合突变,分别为c.913A>T、c.783+1G>C、c.641A>G。这4例患者都患有播散性分枝杆菌感染,其中两例还有非典型伤寒沙门氏菌感染。在PHA刺激下患者外周血T细胞和HVS-T细胞的细胞表面IL-12Rβ1表达缺失;在Mtb或PHA刺激下,患者T细胞IFN-γ分泌下降［18］。

IL-12Rβ2由IL12RB2基因编码,是组成IL-12受体的另一个亚基［16］。Martínez等发现有BCG疫苗接种史的MSMD患者IL12RB2基因发生纯合突变 c.412C>T(p.Q138*)。在IL-12刺激下患者B淋巴细胞系STAT4磷酸化降低,HVS-T细胞、HEK293T细胞的IL-12Rβ2表达缺陷。患者黏膜相关恒定T细胞(Mucosal Associated Invariant T, MAIT)、Th1、分枝杆菌特异性的Th1*(CD4+CXCR3+CCR6+ T细胞)细胞比例均降低,在Mtb刺激下记忆性CD4+T细胞产生IFN-γ的能力受损［16］。

IL-23在活化IFN-γ分泌过程中起着重要作用［20-23］。Markle等发现MSMD患者携带IL23R基因纯合突变 c.344G>A(p.C115Y)。B淋巴细胞系表面IL-23R表达下降,突变IL-23R蛋白糖基化异常,在IL-23刺激下STAT3磷酸化作用受损。同时患者MAIT细胞、Th1、Th1*细胞群比例偏低。用Mtb的刺激患者Th1*细胞,IFN-γ分泌下降［16］。

ISG15基因是一种干扰素激活基因,其主要被IFN-α/β、感染等因素激活,从而诱导NK细胞和T细胞产生IFN-γ［24-28］。Bogunovic等研究3例MSMD患者发现两种ISG15基因纯合突变,分别为c.379G>T(p.Glu127)、c.336_337insG(p.Leu114fs)。患者感染EB病毒的B细胞(EBV-B细胞)在IFN-α刺激下ISG15分泌缺失,同时在SV40成纤维细胞中未检测到ISG15和ISGylation,说明ISG15产生和功能均受损［27］。用BCG或BCG和IL-12刺激患者全血细胞发现IFN-γ分泌下降。

TYK2是一种JAK激酶,参与四种细胞因子(IL-12、IL-23、IFN-α和IL-10)介导的信号通路［29-31］。在对3例幼年发病的MSMD患者的研究中发现一种TYK2基因纯合突变 p. P1104A。在IL-23刺激下,TYK2参与的JAK2-STAT3信号通路明显异常,患者Th17、Th1和记忆性T细胞IFN-γ产生均下降［30］。

RORγT在Th17的分化、3型先天淋巴样细胞的发育和γδT细胞的功能中均起关键作用［32-35］,可以激活IL-17A、IL-17F和IL-23R的转录［32,36］。Okada等研究了7例MSMD患者,其中6例患有皮肤黏膜念珠菌感染。基因分析发现3种RORC基因纯合突变。转染突变基因使HEK293T细胞的RORγ/RORγT表达完全缺失。患者MAIT细胞、NKT细胞缺乏,且γδ和αβT细胞的IL-17A/IL-22产生下降,Th17细胞分泌IL-17A显著下降,这可能与患者同时感染皮肤黏膜念珠菌相关。在BCG和IL-12刺激下,患者Th1*细胞、γδT细胞的IFN-γ分泌量显著下降［37］,这导致了分枝杆菌的感染。

上述8个基因的突变均能引起IFN-γ表达量下降,或同时伴有IL-12/IL-23等其它细胞因子表达下降,这些细胞因子和IFN-γ在先天性和适应性免疫中都发挥着重要作用,它们的表达下降使患者抵抗弱毒力分枝杆菌能力明显减弱,造成弱毒力分枝杆菌易感。

1.2 影响IFN-γ免疫反应的基因 IFN-γ主要通过JAK-STAT通路发挥免疫效应,如刺激巨噬细胞活化、促进抗原提呈细胞APC呈递抗原等,与MSMD相关的基因突变也可以直接导致IFN-γ作用能力下降,从而使其介导的免疫反应受损,与此相关的基因有IFNGR1、IFNGR2、JAK1、STAT1、CYBB。

IFNGR1和IFNGR2编码的IFN-γR1和IFN-γR2组成IFN-γR复合物。IFN-γR1缺失会导致IFN-γ作用功能严重受损［38］。一项研究发现4例MSMD患者IFNGR1基因发生纯合突变 c.395C>A。患者中性粒细胞、淋巴细胞表面的IFN-γR1表达缺陷,同时用IFN-γ刺激患者PBMCs其TNF-α产生也下降［39］,EBV-B细胞IFN-γR1与IFN-γ的结合能力下降［40］。除了隐性遗传(AR)模式外,1999年研究首次发现IFN-γR1的显性遗传(AD)模式,尽管AD的症状没有AR严重,AD也会导致IFN-γ抗菌作用受损,致使患者分枝杆菌易感［41］。

IFN-γR2缺失也会导致IFN-γ作用功能受损。Dorman等发现1例未接种过BCG的男性MSMD患者携带IFNGR2纯合突变c.278-279del。在IFN-γ刺激下患者PBMC的TNF-α产生下降且STAT1磷酸化水平降低［42］。继1998年首次发现IFNGR2基因突变,研究者陆续报道了多种纯合突变以及杂合突变。尽管IFN-γR2表达没有完全缺失［43］,杂合突变患者也能通过阻碍JAK-STAT信号通路使IFN-γ介导的免疫作用受损,致机体分枝杆菌易感。

JAK1属于JAK家族,是一种非酪氨酸激酶。Eletto等对1例同时感染Mtb、玛尔摩分枝杆菌和瘰疬分枝杆菌的MSMD患者的研究发现,JAK1基因存在两个纯合突变c.2198C>T(p.P733L)、c.2494C>T(p.P832S)。两种突变均会抑制JAK1的表达。IFN-α或IFN-γ刺激患者成纤维细胞,STAT1的磷酸化水平降低。此外,与P832S相比,P733L对JAK1功能缺失的影响更严重。JAK1突变使JAK1-STAT1信号通路受损导致IFN-γ作用能力下降,造成患者对分枝杆菌的易感性［44］。

STAT1是STAT家族最重要的成员之一［45,46］。Dupuis等通过对2例MSMD患者研究发现STAT1基因发生杂合突变 c.2116T>C(p.L706S)。用IFN-γ刺激患者EBV-B细胞,STAT1磷酸化水平下降;IFN-γ刺激患者SV40成纤维细胞,STAT1的核转运降低［47］。近年有研究发现STAT1新突变c.1892T>C, p.Val631Ala［48］,这些研究都表明STAT1突变可以使IFN-γ刺激介导的JAK-STAT信号通路受损,使机体更易发生胞内病原体感染［49-53］。

CYBB基因编码吞噬细胞NADPH氧化酶的gp91phox亚基,参与调节活性氧的形成和呼吸爆发。Bustamante等发现7例MSMD男性患者携带两种X染色体CYBB隐性突变XR(p.T178P、p.Q231P)。在单核细胞源性巨噬细胞中,CYBB突变通过影响gp91phox的表达致NADPH活性受损,影响该细胞的呼吸爆发。鉴于巨噬细胞的呼吸爆发是人体抵抗分枝杆菌重要的免疫机制,且IFN-γ在其中发挥重要作用［54］,故CYBB突变可以间接影响IFN-γ作用,使IFN-γ激活巨噬细胞作用受损从而导致分枝杆菌更易发生免疫逃逸。

与影响IFN-γ表达从而间接影响其作用机制的基因突变不同,上述5个基因突变的发病机制都与直接导致IFN-γ作用能力下降相关,IFN-γ相关免疫功能受损致弱毒力分枝杆菌易感。

1.3 同时影响IFN-γ表达和免疫反应的致病基因 IRF8、SPPL2A、NEMO、TBX21基因突变不仅可以使IFN-γ产生下降从而导致IFN-γ相关免疫反应受损,也可以通过直接影响IFN-γ作用能力致IFN-γ免疫相关功能受损。

IRF8编码IRF8蛋白可以反式激活IL12B、NOS2基因转录。Hambleton等发现3例有BCG接种史的MSMD患者携带两种IRF8突变 p.K108E、p.T80A。其中p.K108E为纯合突变,患者全血细胞IFN-γ、IL-12、IL-23分泌均下降,且患者组织DC细胞、血液DC细胞和血液单核细胞严重缺失,同时组织巨噬细胞也出现不同程度的缺失。p.T80A为杂合突变导致CD1c+CD11c+树突状细胞(cDC2s)数量下降且PBMCs的IL-12、IL-23产生下降。两种突变均会导致IRF8蛋白的反式激活功能均受损,下调IL-12B、NOS2基因的转录［55］。NOS2蛋白参与巨噬细胞对胞内菌非特异性的免疫防御机制,IFN-γ通过激活NF-κB、STAT1等促进NOS2的表达,并以此控制分枝杆菌的感染,IRF8基因突变使IRF8蛋白反式激活NOS2基因转录功能受损,同时降低IFN-γ产生水平,致使IFN-γ介导的免疫防御能力下降,分枝杆菌更易发生免疫逃逸［56,57］。

SPPL2a是一种信号肽酶,可以通过降解CD74的跨膜部分(NTF)调节APC的抗原递呈功能。Kong等发现3例有BCG疫苗接种史的MSMD患者携带两种SPPL2A基因纯合突变 c.733+1G>A、c.1328-1G>A,这两种SPPL2A突变都会导致SPPL2a蛋白水平下降,无法切割分解单核细胞和B细胞内CD74 NTF,以致CD74 NTF沉积。患者树突状细胞(Dentritic cell, DC)前体细胞发育受损、cDC2s细胞缺乏,其中cDC2s细胞缺乏机制可能与CD74 NTF沉积毒性有关。cDC2s细胞缺乏进一步导致IL-12、IL-23分泌下降,同时患者Th1*细胞产生IFN-γ的能力也受损［58］。SPPL2A突变可以使IFN-γ分泌下降,同时突变致CD74 NTF沉积会阻断HLA II类蛋白向细胞表面定向转运,从而导致IFN-γ促进APC的抗原提呈功能受损［59,60］,患者体内由IFN-γ介导的适应性免疫降低进而致患者分枝杆菌易感。

NEMO参与组成IKK复合物(与NF-κB结合的IκBα蛋白),可以激活NF-κB信号通路。Filipe-Santos等研究了3例播散性分枝杆菌感染的MSMD患儿,基因检测发现X染色体上两种NEMO基因隐性突变(XR):c.944 A>C(p.E315A)、c.956 G>A(p.R319Q)。在PHA刺激下,患者分泌的IL-12和IFN-γ的产生均受损。研究证实c.956 G>A患者NEMO突变可以影响单核细胞、DC细胞的c-Rel(NF-κB家族成员)的核转运功能,通过延迟c-Rel的核转运而进一步损害CD40激活NF-κB信号通路功能,导致IL-12产生下降从而影响IFN-γ分泌［61］,故NEMO突变不仅能降低IFN-γ产生,还能使其激活NF-κB信号通路功能受损进一步降低相关免疫作用［62,63］。

TBX21基因编码T-bet,是一种与Th1细胞发育相关的关键转录因子,在细胞免疫机制和免疫防御中起着关键作用［64-66］。Yang等对1例在3个月接种BCG后发生全身播散性分枝杆菌感染的男孩进行研究发现TBX21基因纯合突变(c.466_471delGAGATGinsAGTTTA;p.Glu 156_Met 157 delins SerLeu),转染突变基因的HEK293T细胞T-bet表达明显下降,TBX21基因抑制细胞和患者HVS-T细胞的IFN-γ产生显著下降。患者Th1、MAIT、Vδ2+γδT、iNKT、NK细胞群比例均降低,且Th1、Vδ2+γδT、iNKT、NK细胞的IFN-γ产生均显著下降。同时TBX21基因突变会使其下游基因的转录表达均下降,包括CCL1、CCL13、CCL13、CCL4、CSF2、CXCR5、GZMM、CD40、CD86、IL7R、IL-10、LTB、ITGA5以及ITGB5,下游基因中多个基因可编码参与IFN-γ介导的免疫防御机制的免疫蛋白,故TBX21基因突变可以通过多种途径使IFN-γ介导的免疫作用受损,同时降低IFN-γ分泌从而使患者分枝杆菌易感［8］。

上述4个基因突变在影响IFN-γ表达之外还分别影响NOS2基因表达、APC的抗原提呈功能、NF-κB信号通路等,这些功能均受IFN-γ调控,在对IFN-γ的多重影响下,患者抗弱毒力分枝杆菌能力下降。

此外,最近的研究发现与MSMD相关的新致病基因ZNFX1。ZNFX1是一种RNA结合蛋白,最近有报道称,ZNFX1基因突变会导致严重的家族性免疫缺陷,干扰素能刺激ZNFX1基因表达［67］。Vavassori等对15例免疫缺陷患者进行研究,发现其中13例患者均有ZNFX1突变,包括纯合和杂合突变(p.R900Mfs*5/p.H542Cfs*41、p.K133*/ p.K133*、p.C1264S/E1727Kfs*11)［68］。在另一项关于MSMD患者研究中发现两种ZNFX1基因纯合突变(p.E1606Rfs*10、p.S959*)［69］。ZNFX1能调控下游ISGs表达,患者纤维母细胞表达ZNFX1受损,胞外感染时其IFN-α、IFN-β和下游其他ISG蛋白的产生下降,患者发病机制与其体内I型和III型干扰素介导的抗感染作用受损有直接关系［68］。目前还没有直接证据可以证明ZNFX1基因突变可以影响IFN-γ的表达和效应能力,Voyer等推测ZNFX1可能通过影响髓系细胞的某些亚群调节IL-12p70、IL-23和ISG15表达［69］,从而间接影响IFN-γ介导的炎症反应使患者分枝杆菌易感。ZNFX1突变对IFN-γ相关免疫反应及其抗菌免疫机制仍需要进一步探索。

2 小结

目前已经发现有18种基因与MSMD相关,绝大多数基因突变可以导致先天性IFN-γ免疫缺陷以致MSMD患者易感BCG等弱毒力分枝杆菌。虽然靶向MSMD发病机制的研究取得较大的进展,但至少有50%的MSMD患者尚未发现遗传病因［70］。如今全外显子组测序和全基因组连锁分析广泛应用,有助于发现更多的致病基因并进一步阐明MSMD遗传病因,对指导临床诊断和治疗具有重要的意义。