高抗氧化活性玉米醇溶蛋白短肽-黄色素复合物制备技术研究

苏 情，韩 迪，2，田晓闽，3，龚魁杰，刘开昌，郭玉秋，陈利容，王兴亚

（1.山东省农业科学院作物研究所，山东 济南 250100；2.烟台大学，山东 烟台 264000；3.青岛农业大学，山东 青岛 266000；4.山东省农业科学院，山东 济南 250100）

0 引言

玉米蛋白粉是玉米籽粒经湿磨法工艺制得粗淀粉乳，再经蛋白质分离得到麸质水，然后浓缩干燥而制得，又称“黄粉”[1]，作为玉米淀粉生产过程中最大的副产物，当前得到广泛研究。玉米醇溶蛋白是玉米中的主要储藏蛋白，可以溶于60%～95%的乙醇-水溶液，玉米蛋白粉中醇溶蛋白占总蛋白质的50%～70%[2-3]。玉米醇溶蛋白具有良好的成膜性、生物降解性、抗氧化性、黏结性和凝胶性等，使其在复合膜、包埋剂、乳化剂、生物活性肽等领域有广泛的应用[4-5]。研究表明[6]，酶解改性可以改善玉米醇溶蛋白的功能特性，张瑞等人[7]研究发现经酶解处理后的分子量小于1 000 Da的蛋白短肽抗氧化性明显增强，有利于扩大醇溶蛋白的应用范围。

玉米黄色素是一种纯天然的色素，有着极高的营养价值，不但有抗菌消炎、防治心血管疾病、降血脂、降血压、抗突变等功效，而且还能够抗衰老、抗脂质过氧化、抗癌、防癌。直接从玉米籽粒中提取玉米黄色素存在困难[8]，从玉米蛋白粉中共提取醇溶蛋白和黄色素，可以节约资源，减少醇溶蛋白、黄色素分别提取造成的环境污染。因此，基于玉米醇溶蛋白-黄色素共提取技术优化，通过酶解处理制备高抗氧化活性玉米醇溶蛋白短肽-黄色素复合物，能够为玉米副产物深加工技术和高值化利用提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料

碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司提供；L-谷胱甘肽（还原型）、β-胡萝卜素，上海源叶生物科技有限公司提供；其余试剂均为分析纯。

AL104型电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司产品；旋转蒸发器-SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，上海亚荣公司产品；SHA-B型数显恒温水浴振荡器，天津赛得利斯公司产品；UV-2600型紫外可见分光光度计，日本岛津公司产品；BACO-3E型真空冷冻干燥仪，德国Zirbus公司产品；液相色谱仪，安捷伦公司产品；Kjeltec 8400型全自动凯氏定氮仪，丹麦FOSS公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米醇溶蛋白-黄色素提取条件优化

（1）单因素试验。准确称取去淀粉的玉米蛋白粉3 g，中间条件控制为时间60 min，乙醇体积分数65%，料液比1∶10，温度60℃。分别测定温度为20，40，60，80℃；时间为20，60，120，180，240 min；乙醇体积分数为60%，70%，80%，90%，95%；料液比为1∶3，1∶5，1∶10，1∶15，1∶20对玉米醇溶蛋白-黄色素复合物含量的影响。分别利用凯氏定氮法测定蛋白含量，比色法测定黄色素含量（用β-胡萝卜素做标准曲线）。

（2）正交试验。根据单因素试验结果，分别设计玉米醇溶蛋白和黄色素含量的四因素三水平的正交试验，选用L9（34）正交表进行相应的正交试验，计算每次试验醇溶蛋白或黄色素的含量，可以得到正交试验的最佳参数。

醇溶蛋白正交试验因素与水平设计见表1，黄色素正交试验因素与水平设计见表2。

表1 醇溶蛋白正交试验因素与水平设计

表2 黄色素正交试验因素与水平设计

1.2.2 玉米醇溶蛋白短肽-黄色素复合物的制备

取适量1.2.1最佳条件提取的玉米醇溶蛋白-黄色素复合物，按料液比1∶20，pH值9.0，碱性蛋白酶添加量4 000 U/g，温度50℃，酶解2 h，100℃下灭酶10 min，冷却后以转速4 000 r/min离心15 min，除去大分子物质，上清液冻干，制备得到碱性蛋白酶改性玉米醇溶蛋白短肽-黄色素复合物，产物标记为“碱”。依据此方法，中性蛋白酶处理条件为pH值7.0，酶添加量3 000 U/g，温度50℃，产物标记为“中”。胰凝乳蛋白酶处理条件为pH值8.0，酶添加量10 000 U/g，温度37℃，产物标记为“胰”，碱性蛋白酶加中性蛋白酶复合处理组酶解顺序为先碱性后中性，产物标记为“碱+中”，碱性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶复合处理组产物标记为“碱+胰”。

1.2.3 醇溶蛋白含量测定方法

使用国标GB 5009.5—2016方法测定醇溶蛋白含量。

1.2.4 黄色素含量测定方法

参考李晓玲等人[8]的方法测定黄色素含量。

1.2.5 玉米醇溶蛋白酶解产物分子量分布测定

参考Chen K等人[9]的方法，采用高效液相色谱法测定玉米醇溶蛋白短肽的分子量分布。

1.2.6 玉米醇溶蛋白短肽-黄色素复合物DPPH清除率测定

参考刘速速等人[10]的方法，将酶解后的样品配置成10 mg/mL的溶液，取稀释液2 mL，加入浓度为0.1 mol/L的DPPH无水乙醇溶液2 mL，混匀后在室温避光反应30 min，于波长517 nm处测定吸光度，以谷胱甘肽作对照组。清除率计算见公式（1）：

试中：Ac——用无水乙醇代替样品液时的吸光度；

Aj——加样品用无水乙醇代替DPPH时的吸光度；

Ai——加样品与DPPH时的吸光度。

2 结果与分析

2.1 温度对醇溶蛋白和黄色素含量的影响

温度对醇溶蛋白和黄色素含量的影响见图1。

由图1可知，其他条件一定时，随着温度的升高，提取出蛋白含量和黄色素含量均呈先增加后降低趋势，且均在60℃时表现出最佳提取率。因此，醇溶蛋白和黄色素正交试验温度因素均采用50，60，70℃这3个水平。

2.2 时间对醇溶蛋白和黄色素含量的影响

时间对醇溶蛋白和黄色素含量的影响见图2。

图2 时间对醇溶蛋白和黄色素含量的影响

由图2可知，其他条件一定时，随着时间的延长，提取醇溶蛋白含量和黄色素含量均呈先增加后降低趋势，且均在120 min时表现出最佳提取率。因此，醇溶蛋白和黄色素正交试验时间因素均采用60，120，180 min这3个水平。

2.3 乙醇体积分数对醇溶蛋白和黄色素含量的影响

乙醇体积分数对醇溶蛋白和黄色素含量的影响见图3。

图3 乙醇体积分数对醇溶蛋白和黄色素含量的影响

由图3可知，其他条件一定时，随着乙醇体积分数的增加，提取出蛋白含量呈先增加后降低趋势，在乙醇体积分数为70%时表现出最佳提取量，黄色素含量随着乙醇体积分数的增加而增加；当乙醇体积分数为95%时，黄色素含量最高，为0.18 mg/g。因此，醇溶蛋白正交试验乙醇体积分数因素采用65%，75%，85%这3个水平；黄色素正交试验乙醇体积分数因素采用75%，85%，95%这3个水平。

2.4 料液比对醇溶蛋白和黄色素含量的影响

料液比对醇溶蛋白和黄色素含量的影响见图4。

图4 料液比对醇溶蛋白和黄色素含量的影响

由图4可知，其他条件一定时，随着料液比的增加，提取醇溶蛋白含量呈先增加后降低趋势，在料液比为1∶10时表现出最佳提取量，为1 654.42 mg。黄色素含量随着料液比的增加而增加，当料液比为1∶20时，黄色素提取率为最高，为0.193 mg/g。因此，醇溶蛋白正交试验料液比因素采用1∶8，1∶10，1∶12这3个水平；黄色素正交试验乙醇体积分数因素采用1∶8，1∶10，1∶12这3个水平。

2.5 正交试验结果

醇溶蛋白正交试验结果分析见表3。

表3 醇溶蛋白正交试验结果分析

由表3可知，对于醇溶蛋白的影响因素程度大小顺序为料液比〉乙醇体积分数〉温度〉时间，即温度70℃，时间60 min，乙醇体积分数65%，料液比1∶12。

黄色素正交试验结果分析黄色素见表4。

由表4可知，对于色素影响程度大小顺序为乙醇体积分数〉料液比〉时间〉温度，即温度60℃，时间180 min，乙醇体积分数95%，料液比1∶12。

表4 黄色素正交试验结果分析黄色素

综合考虑醇溶蛋白与色素的影响因素，由于色素含量很低，制定最佳条件仍然以醇溶蛋白为主导，最终确定提取条件为温度70℃，时间120 min，乙醇体积分数75%，料液比1∶12。在此条件下，提取出来的醇溶蛋白的含量为1 811.6 mg，提取率可达60.73%，黄色素提取量可达到0.37 mg/g，均保持较高水平。

2.6 玉米醇溶蛋白短肽的分子量分布

玉米醇溶蛋白短肽的分子量分布见图5。

图5 玉米醇溶蛋白短肽的分子量分布

利用蛋白酶法获得不同分子量分布的蛋白水解物，是提高玉米醇溶蛋白抗氧化活性的常用方法[11]。根据液相色谱结果得到了玉米醇溶蛋白具体分子量分布范围。如图5所示，经蛋白酶处理的玉米醇溶蛋白短肽的分子量范围基本分布在1 000 Da以下。有研究表明[12]，分子量在1 000 Da以下的低聚肽，抗氧化性较强，且极易被人体吸收。根据李艳红[13]的研究，多肽分子量在500～1 000 Da时，抗氧化性更明显。因此，根据图5，玉米醇溶蛋白短肽含量在500～1 000 Da的百分比的结果可知，不同蛋白酶处理组抗氧化性高低排序为胰〉碱+胰〉碱+中〉中〉碱。

2.7 玉米醇溶蛋白短肽-黄色素复合物的DPPH自由基清除率

玉米醇溶蛋白短肽-黄色素复合物的DPPH自由基清除率见图6。

由图6可看出，样品质量浓度均为10 mg/mL时，谷胱甘肽的DPPH自由基清除率为93.94%，玉米醇溶蛋白短肽-黄色素复合物的DPPH自由基清除率均低于谷胱甘肽，其中碱+胰组DPPH自由基清除率最高，达到84.10%，除胰组之外，抗氧化活性结果与2.6结果一致。因此，经碱性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶复合酶解处理玉米醇溶蛋白-黄色素复合物为制备高抗氧化性玉米醇溶蛋白短肽-黄色素复合物的最佳酶解法。

图6 玉米醇溶蛋白短肽-黄色素复合物的DPPH自由基清除率

3 结论

从玉米蛋白粉中共提取玉米醇溶蛋白-黄色素的最佳条件为温度70℃，时间120 min，乙醇体积分数75%，料液比1∶12，玉米醇溶蛋白提取率可达60.73%，黄色素提取量可达到0.37 mg/g。为进一步提升共提物抗氧化活性，采用碱性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶复合酶解方法，制备高抗氧化活性玉米醇溶蛋白短肽-黄色素复合物，DPPH自由基清除率达到84.10%。下一步需要继续开展复合物更多功能活性研究，促进玉米蛋白粉综合利用。