灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料研制

熊亚琴，罗建光

（1.淮安生物工程高等职业学校，江苏 淮安 223232；2.江苏食品药品职业技术学院，江苏 淮安 223023）

灵芝（Ganoderma lucidum）又名赤芝、万年蕈、灵芝草，是一种多孔担子菌亚门药食用真菌的子实体，富含灵芝多糖、灵芝酸、氨基酸、微量元素等物质，具有免疫调节、安神益脑、补气活血、提高机体耐缺氧能力、清除自由基、预防肿瘤等作用[1-4]。发芽糙米含有丰富的维生素B族、生育酚、膳食纤维、肌醇六磷酸盐、γ-氨基丁酸等营养元素，其中γ-氨基丁酸对改善人体的神经系统、心血管系统、新陈代谢、肝脏功能具有良好的功能[5]。蒲公英又名婆婆丁、黄花地丁，多年生草本植物，有“天然抗生素”的美誉，为传统药食同源材料，含有丰富的甾醇、菊糖、胆碱、有机酸、维生素、胡萝卜素、微量元素等，具有抗菌消炎、清热解毒、健胃散结、消肿利尿、保肝利胆、抗病毒等功能[6-11]。

目前，随着饮料产业不断转型升级，健康化、营养化饮料的研究开发越来越受到重视。以灵芝子实体、发芽糙米和蒲公英为原料开发的产品较多[12-14]；而以发芽糙米为主要原料，通过灵芝液体发酵和添加野生蒲公英提取物研制复合饮料的研究在国内尚未见报道。为此，以发芽糙米为原料进行灵芝液体发酵，获得灵芝发酵液，再添加蒲公英提取物、木糖醇和柠檬酸等辅料，开发出一种既具有独特风味和清鲜口感，又保留了灵芝、发芽糙米和蒲公英原有营养保健功效的复合饮料，为灵芝、发芽糙米和蒲公英进一步开发利用提供理论支持，开辟出灵芝、发芽糙米和蒲公英等相关复合饮料研制的新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌种:灵芝（赤芝，红灵芝、CICC14042），中国工业微生物菌种保藏管理中心提供。

发芽糙米粉、发芽黄豆粉，新鲜的糙米、黄豆经实验室发芽、烘干、粉碎、过60目筛加工制成。

发芽大麦粉，购自淮安广济大药房，经粉碎过60目筛加工制成。

葡萄糖、NaCl、CaCO3、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4，无锡市亚泰联合化工有限公司提供；蛋白胨、琼脂，上海博微生物科技有限公司提供；麦芽糖，江苏先卓食品科技股份有限公司提供；海藻酸钠、CMC-Na、柠檬酸、木糖醇，河南千志商贸有限公司提供。

1.2 仪器与设备

DLSB-5L/20型低温冷却液循环泵，巩义市子华仪器有限责任公司产品；101-3A型数显式电热恒温干燥箱，上海阳光实验仪器有限公司产品；ZG-1M2型真空冷冻干燥机组，杭州创意真空冷冻干燥设备厂产品；TDL-40C型低速台式大容量离心机，上海安亭科学仪器厂产品；ZWY-2102型恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司产品；SHA-C型恒温水浴振荡器，常州荣华仪器制造有限公司产品；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂产品；SW-CJ-2FD型双人单面垂直净化工作台，江苏通净净化设备有限公司产品；GNP-9050型隔水式恒温培养箱，上海三发科学仪器有限公司产品；RE-3000A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品。

1.3 方法

1.3.1 灵芝发芽糙米发酵液的制备

（1）菌种活化。从灵芝母种斜面上取一块约0.5 cm2大小的菌块置于PDA斜面培养基上，在25℃恒温培养箱中培养7 d，制得活化斜面菌种。

（2）种子培养。在250 mL锥形瓶中装入100 mL种子培养基，高压蒸汽灭菌后冷却至室温，于无菌条件下接入活化的2～3菌块（5 mm2），然后置于摇床中，于28℃下以转速180 r/min培养7 d，制得液体灵芝菌种。

（3）液体发酵。在500 mL三角瓶中装入200 mL液体发酵培养基，高压蒸汽灭菌后冷却至室温，于无菌条件下按5%接种量接入种子培养基，发酵培养7 d（温度28℃，转速180 r/min）。

1.3.2 灵芝发酵液的制备

将液体发酵培养基倒入离心管中离心（离心转速4 000 r/min）→吸取上清液→得到发酵液原液。

1.3.3 蒲公英提取物的制备

将采集的蒲公英洗净、烘干→打成颗粒度较大的粉末（30 s）→过50目筛→加入纯净水在60℃提取2次→抽滤真空泵粗过滤→旋转蒸发仪进行浓缩→真空冷冻干燥成粉末。

1.3.4 灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料加工工艺

原液→加入蒲公英提取物→调配→均质→灌装、排气、封口→加热杀菌→冷却→贴标→成品。

1.3.5 操作要点

①培养基配制时要注意搅拌均匀，以防止沉淀和煳底；②接种要保证在无菌的条件下操作，操作人员应该预先对接种培养基进行灭菌，再在超净工作台下用紫外灯照射15～30 min，再用酒精对带有手套的双手消毒后再进行接种；③接种时接种铲温度不宜过高，会将灵芝菌种烫死；④接种操作时要注意瓶塞摆放的位置、瓶塞与锥形瓶的间距；⑤接种结束后，应立即放置于摇床内进行培养；⑥蒲公英打粉要注意时间应该控制在30～35 s；⑦蒲公英浓缩时应注意旋转蒸发仪中溶液的体积，旋转蒸发的转速不宜过高；⑧蒲公英提取物配制饮料添加时应注意快速称取，防止其吸潮，产生质地上的变化；⑨饮料均质应该注意转速不宜过高，以防止饮料产生大量的泡沫，而影响产品的感官品质。

1.3.6 单因素试验设计

（1）发酵液添加量的确定。以10%，20%，30%，40%，50%的发酵液分别添加4%木糖醇，0.01%柠檬酸，0.45%蒲公英提取物，用纯净水定容至100 mL，即100 mL中发酵液体积分别为10，20，30，40，50 mL，按此方法分别制成的灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料进行感官评定，确定最佳的发酵液添加量。

（2）蒲公英提取物添加量的确定。以添加量0.15%，0.25%，0.35%，0.45%，0.55%的蒲公英提取物分别添加40%发酵液，4%木糖醇，0.01%柠檬酸，用纯净水定容至100 mL，即100 mL中蒲公英提取物添加量分别为0.15，0.25，0.35，0.45，0.55 g，按此方法分别制成的灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料进行感官评定，确定最佳的蒲公英提取物添加量。

（3）木糖醇添加量的确定。以2%，4%，6%，8%，10%的木糖醇分别添加40%发酵液，0.45%蒲公英提取物，0.01%柠檬酸，用纯净水定容至100 mL，即100 mL中木糖醇用量分别为2，4，6，8，10 g，按此方法分别制成的灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料进行感官评定，确定最佳的木糖醇添加量。

（4）柠檬酸添加量的确定。以添加量0.005%，0.010%，0.015%，0.020%，0.025%的柠檬酸都分别添加40%发酵液，0.45%蒲公英提取物，4%木糖醇，用纯净水定容至100 mL，即100 mL中柠檬酸用量分别为0.005，0.010，0.015，0.020，0.025 g，按此方法分别制成的灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料进行感官评定，确定最佳的柠檬酸添加量。

1.3.7 正交优化试验

在单因素试验设计基础上，采用正交试验L9（34）对灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料的配方进行筛选，以灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料的感官评分作为考查指标，通过后期的正交试验考查各个因素相互之间的影响，确定灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料的最佳配方。

灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料正交试验因素与水平设计见表1。

表1 灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料正交试验因素与水平设计/%

1.3.8 稳定剂的选择试验

稳定剂可以抑制因重力作用而沉淀的大分子颗粒下沉，一定程度上让产品长时间保持均一和稳定。试验中选择饮料加工常用的海藻酸钠、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）2种稳定剂，以不同的复配比例按照0.3%添加量进行试验，确定稳定剂的最佳添加量。

1.3.9 产品感官品质评定标准

按照感官综合评分方法，随机选取10名具有食品专业背景和感官评定经验的品鉴人员对灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料样品进行随机感官评价，以其平均分作为该复合饮料的总感官评分。

感官评定标准见表2。

表2 感官评定标准

1.3.10 产品理化及微生物质量评定标准

（1）理化检验。锌测定，参考《GB 5009.14—2017食品安全国家标准 食品中锌的测定》；铜测定，参考《GB 5009.13—2017食品安全国家标准 食品中铜的测定》；铁测定，参考《GB 5009.90—2016食品安全国家标准食品中铁的测定》；氰化物测定，参考《GB 5009.36—2016食品安全国家标准食品中氰化物的测定》；灵芝多糖检测采用苯酚-硫酸比色法[15]；γ-氨基丁酸采用苯酚-次氯酸钠比色法[16]。

（2）微生物检验。菌落总数按《GB 4789.2—2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》计数；大肠菌群按《GB 4789.3—2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》中规定的方法计数；霉菌、酵母按《GB 4789.15—2016食品安全国家标准食品微生物学检验 霉菌和酵母》计数。

2 结果与分析

2.1 发酵液添加量对饮料品质的影响

发酵液添加量对灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料品质的影响见图1。

图1 发酵液添加量对灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料品质的影响

由图1可知，随着发酵液添加量的增大，灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料的感官评分逐渐增加，当添加量为40%时，饮料的感官评分到达最高，考虑可能是在发酵液添加量不足时，饮料溶液的稀释比较大，受到其他因素的影响较大，不足以凸显发酵液的特殊风味，其次在低添加量时，灵芝的有效成分含量不足，无法显现出保健功能。而在发酵液添加量大于50%时，由于发酵液本身具有的苦涩感无法被其他因素所掩盖，而使饮料的感官评分下降，说明添加量过高对感官评定人员来说认可度不高，所以综合考虑选择添加量30%，40%，50%作为正交试验的因素水平。

2.2 蒲公英提取物添加量对饮料品质的影响

蒲公英提取物添加量对灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料品质的影响见图2。

由图2可知，随着蒲公英提取物添加量的增大，灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料的感官评分逐渐增加，当添加量为0.35%时，饮料的感官评分到达最高，当添加量较低时不足以彰显蒲公英的特殊风味与香气，色泽也较淡，而当添加量较高时，蒲公英苦涩味明显，饮料颜色呈现明显的棕黑色和深棕色，不符合大部分感官评定人员的一般口味。蒲公英提取物经过旋转蒸发仪浓缩和真空冷冻干燥，提取物中风味物质浓度比较大，对饮料的色泽和香气影响较大，所以适量添加才更符合大众对饮料的基本要求。因此，综合考虑选择添加量0.35%，0.45%，0.55%作为正交试验的因素水平。

图2 蒲公英提取物添加量对灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料品质的影响

2.3 木糖醇添加量对饮料品质的影响

木糖醇添加量对灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料品质的影响见图3。

图3 木糖醇添加量对灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料品质的影响

由图3可知，随着木糖醇添加量的增大，灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料的感官评分先增加后较为平缓地逐渐降低，先增加的原因在于柠檬酸定量时，适当增大木糖醇添加量，可达到适宜的饮料糖酸比，而后逐渐下降。分析原因为超量的木糖醇对饮料糖酸比影响较大，甜味过高会直接影响饮料的总体滋味，也会增加饮料的制作成本。由于木糖醇本身的甜度是蔗糖的1.2倍，差异度不大，但是木糖醇溶解时会吸收大量的热量，故会产生一种爽口的感觉，对饮料的滋味具有改善作用，但是摄入量过大会造成腹泻等风险，所以综合考虑选择添加量2%，4%，6%作为正交试验的因素水平。

2.4 柠檬酸添加量对饮料品质的影响

柠檬酸添加量对灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料品质的影响见图4。

由图4可知，柠檬酸添加量相对较少，但是感官评分趋势变化较大，随着柠檬酸添加量的增大，灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料的感官评分先增加后呈直线降低，先增加的原因在于木糖醇的固定时，适当增加柠檬酸添加量，可以使饮料滋味达到合适酸甜度，而后稍有增大柠檬酸添加量，便会使饮料的酸感明显；同时，由于柠檬酸的酸感不太柔和，再加上蒲公英提取物中含有一些酸性物质，结果造成饮料的酸感突出，使饮料的感官评分呈直线下降。因此，综合考虑选择添加量0.005%，0.010%，0.015%作为正交试验的因素水平。

图4 柠檬酸添加量对灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料品质的影响

2.5 灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料最佳配方的确定

灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料正交试验结果见表3。

表3 灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料正交试验结果

由表3可知，影响灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料感官评分的主次因素为蒲公英提取物添加量（B）〉柠檬酸添加量（D）〉发酵液添加量（A）〉木糖醇添加量（C）。由此可见，蒲公英添加量对饮料的感官评分的影响显著性较大，得到的最优组合为A2B2C2D1，并不在正交试验的9组试验中，但是通过超过3次的验证试验，其感官评分每次都高于任何一组的试验结果，感官评分得到88分。最终确定灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料的最佳配方为发酵液添加量20%，蒲公英添加量0.35%，木糖醇添加量4%，柠檬酸添加量0.005%。

灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料方差分析结果见表4。

由表4可知，蒲公英添加量和柠檬酸添加量对灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料的显著性较大，所以确定最佳组合时才需要考虑饮料中蒲公英和柠檬酸的最适添加量。

表4 灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料方差分析结果

2.6 稳定剂对产品稳定性的影响

试验参照单垣恺等人[17]方法略作修改，将饮料常用的稳定剂CMC-Na与海藻酸钠进行复配，加0.3%于饮料中，并比较了不同复配比例对饮料稳定效果。

不同稳定剂对灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料稳定性影响见表5。

表5 不同稳定剂对灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料稳定性影响

由表5可知，CMC-Na与海藻酸钠按照1∶2比例进行复配，形成的稳定剂对复合饮料稳定效果最佳，因而，在复合饮料加工过程中，选择0.1%CMC-Na和0.2%海藻酸钠作为复配稳定剂。

2.7 灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料质量标准

2.7.1 感官指标

香气：有灵芝和蒲公英的特殊香气，无异香，无臭味；滋味：有灵芝和蒲公英的应有滋味，无杂味，异味；色泽：具有清亮的棕褐色或淡咖啡色，溶液成半透明状；状态：均匀一致，有一定黏度，无杂质，无沉淀。

2.7.2 产品理化指标

锌、铜、铁总和15 mg/L，氰化物（以HCN计）0.02 mg/L，酸度pH值5.2，可溶性固形物3.1%，γ-氨基丁酸131.62 mg/L，灵芝多糖0.922 mg/L。

2.7.3 产品微生物指标

细菌总数40 CFU/mL，大肠杆菌总数6 MPN/mL，霉菌总数12 CFU/mL，酵母总数9 CFU/mL，致病菌未检出。

3 结论

以研制出一款色香味形较佳的灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料为试验目的，将发酵液添加量、蒲公英提取物添加量、木糖醇添加量、柠檬酸添加量作为4个因素考查，以感官评分作为评定指标，最终通过正交试验，得到产品的最佳配方为发酵液添加量40%，蒲公英提取物添加量0.35%，木糖醇添加量4%，柠檬酸添加量0.005%。此外，复配稳定剂添加量为0.3%（羧甲基纤维素钠与海藻酸钠之比为1∶2）时，灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料稳定性最佳。由此配比制得的灵芝发芽糙米蒲公英复合饮料，具有浓郁的灵芝与蒲公英的特殊香气，风味独特，色泽黄褐。该饮料的各项检测指标均达到国家的标准，符合当代消费者对安全、营养、绿色、功效食品的要求。