北京市场饲料原料及全价饲料中蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌和3种霉菌毒素情况调查

2023-03-08陈亚军袁雪霞

中国饲料 2023年4期

陈亚军，李芳，王韫，董清，袁雪霞，黄芳

（1.北京市大兴区畜牧水产技术推广站，北京 102600；2.北京市通州区动物疫病预防控制中心，北京 101101；3.保定职业技术学院，河北保定 071000）

俄罗斯、乌克兰是全球两大重要粮食出口国，出口额占世界市场总量的12%（钟钰等，2022）。俄乌对国际市场影响严重，我们只能从美国进口饲料原料，但今年美国出现了呕吐毒素蔓延的早期迹象。呕吐毒素（DON）对人畜健康有很大影响，低剂量摄入会造成食欲下降、生长缓慢、发育不良和病死率升高等现象；大量或长期摄入会发生急性中毒、呕吐、直肠出血和腹泻（帕孜来提·依明，2018）。

了解我国饲料行业已经出现的霉菌感染变得十分重要，因此，我们检测了本基地饲料原料及储藏期不同的全价饲料中呕吐毒素、烟曲霉毒素和玉米赤霉烯酮、蜡样芽孢杆菌和烟曲霉菌的污染情况。

1 试验设计

对场内所有的饲料原料、外购全价饲料及自制全价饲料进行抽样，检测样品在高温高湿的环境下饲料中蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌以及呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、烟曲霉毒素的含量。

2 材料

2.1 饲料样品饲料原料：采集麦麸、豆粕、仔猪预混料、玉米、中猪预混料、乳猪浓缩料、仔猪用枯草芽孢杆菌、中猪用畜禽生物复合预混料-活力素、中猪用枯草芽孢杆菌饲料原料共9种，每种2个重复，共计18个。

自制全价料：哺乳仔猪料、断奶仔猪料和育肥猪料，从制成后第0、5、10、15天，采集2个样品，共计24个。

外购全价料：妊娠母猪料、哺乳母猪料、育肥猪饲料，从进入猪舍后第0、5、10、15天，采集2个样品，共计24个。

2.2 试剂与试剂盒营养肉汤培养基、MYP培养基、沙堡罗培养基和PDA培养基均购自北京奥博星生物技术有限公司。呕吐毒素（DON）ELISA检测试剂盒、玉米赤霉烯酮（ZEN）ELISA检测试剂盒和烟曲霉毒素（FB）ELISA检测试剂盒均购自滨州绿都生物技术有限公司。

3 方法

3.1 饲料原料和全价料样品的采集按照试验设计采集样品，用密封袋封口标记后低温迅速送往实验室，放入4℃的冰箱保存。

3.2 蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌分离和培养蜡样芽孢杆菌计数：取25 g样品，用磷酸盐缓冲液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀释，按GB/T4789.2-2010要求，取每个梯度0.1 mL样品稀释液加入培养皿中，加入50～60℃未凝固MYP培养基。凝固后，将培养皿置37℃恒温恒湿培养箱培养12～24 h。将可疑菌落进行菌落形成单位计数。蜡样芽孢杆菌在此培养基上菌落为粉红色，挑取可疑菌落5个做鉴定试验，根据证实的蜡样芽孢杆菌的菌落数计算该平板上的菌落数。

烟曲霉菌培养和计数：按照GB4789.15-2010方法，采用PDA培养基，按1∶10，1∶102，1∶103，1∶104，1∶105梯度，各吸取1 mL菌液加入灭菌的PDA平板中，每个稀释度做2个重复，置于27～29℃霉菌培养箱中培养5 d后计数。

3.3 毒素含量检测按照ELISA试剂盒说明书检测呕吐毒素、烟曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的含量。以标准品百分吸光率为纵坐标，以DON标准品浓度的半对数为横坐标，绘制标准曲线图，计算样本中DON的实际浓度。

4 结果

4.1 饲料原料中蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌及3种霉菌毒素含量检测 9种饲料原料中，蜡样芽孢杆菌检出率100%，其中乳猪浓缩料超过国家细菌允许量标准（国标（G13078-2017））。烟曲霉菌的检出率100%，中猪预混料超过国家霉菌允许量（国标（G13078-2017））。ZEN检出率33.3%，超标率22.2%；DON检出率88.9%，超标率22.2%；FB检出率88.9%，但不超标。其中玉米和中猪用枯草芽孢杆菌ZEN检出值较高，玉米、仔猪用枯草芽孢杆菌和中猪用枯草芽孢杆菌DON检出值较高；中猪预混料、乳猪浓缩料、仔猪用枯草芽孢杆菌FB检出值最高；麦麸、豆粕、仔猪预混料、中猪预混料、乳猪浓缩料中ZEN检出值为0，仔猪预混料中DON检出值为0，玉米中FB检出值为0；仔猪预混料中3种霉菌毒素的检出率都比较低。

表1 饲料原料中蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌及3种霉菌毒素含量

4.2 全价料中蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌及3种霉菌毒素含量将自制仔猪全价料、自制中猪全价料、自制乳猪全价料、外购中猪全价料、外购妊娠乳猪全价料、外购哺乳母猪全价料室温（温度25～27℃，湿度60%～70%）条件下储存，第0、5、10、15天进行监测，以确定不同生长阶段猪只饲料中蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌、DON、FB和ZEN的污染特点及其规律。

4.2.1 自制仔猪全价料中蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌数量及DON、FB和ZEN含量随着储存时间的不断延长，自制仔猪全价料中蜡样芽孢杆菌检出量呈上升趋势。整个储藏过程中均能检测到较高水平的烟曲霉菌污染，第10天开始呈下降趋势。

随着储存天数的不断增加，ZEN检出量逐渐升高，DON检出量呈上升趋势，FB检出量一直维持在较高水平，受储存天数的影响不大。但所有霉菌和毒素含量均低于国家标准。

4.2.2 自制中猪全价料中蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌数量及DON、FB和ZEN含量储藏前期（0～10 d），样品中蜡样芽孢杆菌的检出量呈上升趋势，第15天的检测量有所下降，但仍维持在较高水平。烟曲霉菌、DON、FB均在第5天检出量最高，随后呈现下降趋势。ZEN含量先缓慢上升，在第10天陡然上升，并维持在较高水平。

表2 全价料中蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌数量及DON、FB和ZEN含量

4.2.3 外购中猪全价料中蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌数量及DON、FB和ZEN含量除第15天，外购中猪全价料均未检出蜡样芽孢杆菌和烟曲霉菌污染，检出量分别为3×103和4×102。第10天检出ZEN；仅在第0天检出FB；DON含量呈现下降趋势，在第15天略有上升。

4.2.4 自制乳猪全价料中蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌数量及DON、FB和ZEN含量自制乳猪全价第10和15天检出蜡样芽孢杆菌污染，检出量分别为4×104、5.8×104。整个检测过程中，烟曲霉菌载量均维持在较高水平。ZEN含量虽呈下降趋势，但检测时间内的含量均超过国家标准；DON含量相对检出量也较高，在第10天达到检测峰值；FB含量第0天检出量为0，第15天检测值突然攀升达到最高值。

4.2.5 外购妊娠母猪全价料中蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌数量及DON、FB和ZEN含量外购妊娠母猪全价料重蜡样芽孢杆菌的污染持续存在，且在第5天达到峰值。仅第15天检出1×102的烟曲霉菌。DON和FB含量在第0、5天均未检出，ZEN在第10天检出值达到最高值并超标，FB的检出量仍然维持在较低水平；DON含量在第0、5天基本相同，在第10天出现检测峰值。

4.2.6 外购哺乳母猪全价料中蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌数量及DON、FB和ZEN含量样品中蜡样芽孢杆菌的检出量有上升趋势，第5、10天的检出量分别为2×102、1.1×102，第15天出现检出峰值，检出量为3.4×102；未发现烟曲霉菌污染。DON、ZEN和FB均在第10天出现检测峰值。

4.3 蜡样芽孢杆菌及DON、FB和ZEN的检出率由表3可知，随着储藏时间的不断延长，不同生长阶段的猪饲料中蜡样芽孢杆菌的检出量均有所升高，但烟曲霉菌的检出量呈现出较为明显的下降趋势。而且3种毒素动态检测结果显示，自制饲料中污染DON、FB和ZEN的程度均高于外购成品饲料，同时较高的检出量也可提示DON、FB和ZEN污染严重。

表3 蜡样芽孢杆菌及DON、FB和ZEN的检出率 %

5 讨论

目前我国养殖行业对霉菌毒素的危害意识不够，没有进行污染物含量的检测，而且我国只有部分配合饲料（如猪、禽及犊牛饲料呕吐毒素的限量标准），未制定饲料原料（除DDGS外）中呕吐毒素限量标准（崔华等，2020）。被污染的饲料中氨基酸含量会受到影响，从而降低了饲料的营养价值（闫珊珊等，2020）。而且呕吐毒素等多种毒素叠加增加了毒素的细胞毒性，可引发猪胃溃疡的慢性疾病（王晓敏等，2021）。

王新（2019）用酶联免疫法对2016～2018年河北、内蒙古等6省饲料呕吐毒素污染情况进行了调查，结果显示，我国玉米中呕吐毒素污染处于中等污染程度，这表明华北地区的饲料被污染情况十分严重。徐咏宁等（2020）研究表明，夏秋季节高温高湿环境易于蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌等的滋生，因此，储存过程中应注意环境控制。