外源水杨酸对盐胁迫下三叶草种子萌发特征的影响

吴志毅，曹克璠，陈海军，刘嘉伟，刘 鑫，单玉梅，包立高，王明玖

(1.包头市生态环境局综合保障中心/包头市生态环境监控监测中心，内蒙古 包头 014060；2.草地资源教育部重点实验室/农业农村部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室/内蒙古自治区草地管理与利用重点实验室/内蒙古农业大学 草原与资源环境学院，内蒙古 呼和浩特 010011；3.内蒙古科学技术研究院，内蒙古 呼和浩特 010070；4.包头市农畜产品质量安全中心，内蒙古 包头 014010；5.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；6.内蒙古自治区农牧业技术推广中心，内蒙古 呼和浩特 010030)

1 引言

土壤盐碱化是一个全球性问题。据统计，全球的盐碱地以每年约10×105hm2的速度增长[1]，20%的耕地受到不同程度的影响。盐碱地会抑制作物的生长，因此，提升作物的耐盐性并研究其机理是提高作物生长发育的关键[2,3]。盐胁迫是对植物生长发育中重要的非生物胁迫因子，抑制植物种子萌发[4]。植物受到盐胁迫时，外部形态和内部生理均会发生不良的变化，植株生长会减慢，生物产量会降低，严重影响着植物生产[5]。

水杨酸(salicylic acid，SA)，化学名为邻羟基苯甲酸，在植物体内普遍存在的、易溶于有机溶剂的小分子酚类化合物，是一种非生物逆境反应得信号分子[6,7]，可调节植物生长发育、增加植物抗病性，调节气孔运动、诱导花熟。

高加索三叶草(Trifoliumambiguum)，为豆科多年生根蘖型长寿命牧草，根系发达且入土深，在寒、旱的条件下能表现出较强的农艺潜力[8]；白三叶(T.repens)是世界上最重要的多年生豆科牧草之一，固氮能力较好，但其耐寒性和耐旱性较差[9]；为了获得兼具二者优良性状的三叶草品种，内蒙古农业大学牧草育种团队利用高加索三叶草和白三叶杂交并通过胚拯救培养技术获得二者的杂交后代，研究发现杂交后代品系仍具备较强的抗逆性、但无法自发的结瘤固氮；红三叶(Trifoliumpretense)又叫红车轴草，多年生草本，是车轴草属的最重要物种之一[10]。

进入21世纪以来，众多学者开始研究水杨酸对植物逆境下的影响和作用机理，并得出相应结论。SA在植物逆境反应中起到关键性作用，不仅能减少高温带来的氧化胁迫的危害，而且可以显著改善植物的耐盐性[11，12]；Pancheva等[13]研究水杨酸对小麦的影响时发现，水杨酸处理后的小麦，光合系统捕获光能的效率增加，叶黄素与类胡萝卜素含量均有所提升，去环氧化能力增强；马广民等[14]研究发现，水杨酸处理的西瓜幼苗，受到盐害时体内渗透调节物质大幅增加，SA浓度为0.01、0.05 mM处理显著提高了西瓜幼苗的株高、茎粗及叶面积；唐艳萍等[19]研究表明，用水杨酸浓度为0 mM、0.1 mM、0.5 mM和0.9 mM 浸泡处理大豆幼苗根系，水杨酸对水分胁迫下的大豆幼苗保持较高的光合速率，促进相关抗水分胁迫基因的表达。王玉萍[15]研究发现，盐胁迫下，用1.0 mmol/L的SA处理花椰菜种子后，显著提高了其耐盐性。闫艳华[7]发现0.05 mmol/L的SA浸种后，减轻了盐胁迫对燕麦的伤害，促进了其种子的萌发和幼苗的生长。

本研究从使用生物措施提高植物盐害抗性出发，通过纸上发芽床的试验方法，用不同浓度的水杨酸对高加索三叶草杂交后代种子进行浸种，探究其在盐胁迫下萌发的影响，初步探索水杨酸对高加索三叶草杂交后代耐盐性的互作关系，为以后水杨酸对高加索三叶草耐盐性的研究提供有价值的参考。

2 材料与方法

2.1 试验材料

供试材料为白三叶、红三叶和高加索三叶草以及高加索三叶草与白三叶杂交后代的成熟种子，以NaCl处理为一级处理，SA浸种为二级处理，以蒸馏水浸种为对照(CK)，共设置18个处理，每个处理重复3次，具体处理组合如表1所示。

表1 处理方案

2.2 试验方法

试验采用纸上发芽床法，由于车轴草属植物的种子硬实率高，种子在发芽实验前先用砂纸对种皮进行打磨。种子用水选法，去除水面漂浮的杂质以及不饱满的种子。将种子浸于0.1% HgCl2溶液中消毒10 min后，用蒸馏水洗涤3～4次。将种子浸泡于6个水杨酸(SA)浓度溶液中处理24 h后，蒸馏水漂洗3～4次，再用滤纸擦拭种子，吸干表面的水分。将两层滤纸铺放于直径为9 cm的培养皿(已消毒)中，倒入盐溶液使滤纸吸水到饱和状态，以培养皿倾斜45°无明水为准。然后挑选均匀一致、无破损的50粒种子整齐摆放在培养皿中，每个培养皿加入等量的处理盐溶液。每个处理重复3次。将所有种子都放入25 ℃的恒温培养箱(培养箱用75%的乙醇进行消毒)中培养7 d。每间隔24 h观察一次种子萌发的状况，记录种子萌发个数，以肉眼能够观察到白色幼根判断是否萌发。种子萌发过程中保持滤纸饱和，每3 d更换1次滤纸。培养第7 d时选取10株幼苗测量的根长、芽长及重量，并计算萌发指标。

2.3 数据处理

运用Excel 2016软件进行数据整理、萌发指标的计算以及灰色关联度的计算，釆用SPSS 20.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan方法多重比较，显著水平设置为0.05，并用Origin 2018软件作图。

统计计算公式：

发芽势(%)=(发芽初期(指定日期内)正常发芽种子数/供检验种子数)×100%；

发芽率(%)=(发芽末期(指定日期内)正常发芽种子数/供检验种子数)×100%；

发芽指数(GI)=Σ(Gt/Dt)。Gt为第t天种子发芽数；Dt为对应的种子发芽的天数。

活力指数=生物学产量(植株的全部干重)×发芽指数。

3 结果与分析

3.1 SA对盐胁迫下白三叶萌发的影响

盐胁迫影响种子发芽率，相同水杨酸浓度下，盐浓度增加发芽率则降低。在相同盐处理下，盐浓度为0 mM时，SA为0.1 mM时发芽率与对照无差异(P>0.05)，SA为0.4 mM的发芽率63.33%为最低，显著低于对照(P<0.05)。盐浓度为50 mM，0.2 mM SA发芽率最低，SA为0.4 mM时发芽率24.11%为最高，与对照和0 mM差异显著(P<0.05)。盐浓度为100 mM时，0.1 mM SA发芽率23.22%为最高，SA浓度增大发芽率下降。

盐胁迫降低种子的发芽势。相同水杨酸浓度下，盐浓度升高发芽势降低。在相同盐处理下，盐浓度为0mM时，SA为0.1 mM发芽势最低为52%，与对照显著差异(P<0.05)；盐浓度为50 mM时，SA为0.4 mM发芽势最高为24.67%，差异不明显(P>0.05)。盐浓度为100 mM时，水杨酸浓度增加发芽势下降，SA为0.1 mM发芽势最高。

相同水杨酸浓度下，盐胁迫使发芽指数降低。在同一盐处理水平下。盐浓度为50 mM时，SA为0.3 mM发芽指数最高13.59。盐浓度为100 mM时仅SA为0.3 mM发芽指数无显著差异，其它浓度有显著差异(P<0.05)。

相同水杨酸浓度下，盐胁迫使活力指数降低，与对照有显著差异(P<0.05)。在相同盐处理下，盐浓度为0 mM时，SA为0.2 mM的活力指数显著高于对照(P<0.05)。当盐浓度为50 mM，SA为0.3 mM时的活力指数显著高于对照(P<0.05)，此时的活力指数最高。当盐浓度为100 mM，SA为0.3 mM时的活力指数最高。

盐胁迫下根、芽生长均受到阻碍，在相同水杨酸浓度下，根与芽的长度显著低于对照(P<0.05)。相同盐处理下，SA为0.4 mM时的根与芽的长度显著长于对照(P<0.05)。

综合以上结果，盐胁迫抑制白三叶种子的萌发，适宜水杨酸浓度浸种对其有缓解作用，有效促进该品系种子的萌发力，但高浓度水杨酸会抑制种子萌发。SA 0.4 mM为最适宜浓度(图1)。

图中同一水杨酸处理水平下不同盐浓度间差异不显著(P>0.05)为相同大写字母，同一盐胁迫水平下不同水杨酸处理间差异不显著(P>0.05)为相同小写字母，下同。图1白三叶萌发指标

3.2 SA对盐胁迫下红三叶萌发的影响

相同水杨酸浓度下，盐浓度为50 mM发芽率最高，100 mM发芽率最低。在相同盐处理下，盐浓度为0 mM时，SA为0.4 mM的发芽率25%为最低。盐浓度为50 mM，除SA为0 mM、0.1 mM外，其余浓度有显著差异(P<0.05)。盐浓度为100 mM时，SA为0.1 mM时发芽率18.33%为最高。

相同水杨酸浓度下，除SA为0.4 mM的其它浓度，50 mM盐处理发芽势最高。在相同盐处理下，盐浓度为0mM时，SA为0.2 mM发芽势最低为21.33%，0.5 mM发芽势最高为55.33%，且差异显著(P<0.05)。盐浓度为50 mM时，SA为0.1 mM发芽势最高82%，显著高于对照和0 mM处理47.33%和74%。盐浓度为100 mM时，SA为0.1 mM发芽势最高。

相同水杨酸浓度下，盐浓度为50 mM发芽指数最高，100 mM发芽指数最低。在相同盐处理下，盐浓度为0 mM时，与对照相比SA 各浓度均显著(P<0.05)。

相同水杨酸浓度下，除SA为0.4 mM的其它浓度，50 mM活力指数最高。在相同盐处理下，盐浓度为0 mM时，SA 各浓度与对照相比差异显著(P<0.05)，SA为0.4 mM时的活力指数最高。当盐浓度为50 mM，SA 各浓度与对照相比差异显著(P<0.05)，但与SA为0 mM差异不显著(P>0.05)。当盐浓度为100 mM，SA 各浓度与对照相比差异显著(P<0.05)，但与SA为0 mM没有显著差异(P>0.05)。

盐胁迫抑制根、芽的生长，在相同水杨酸浓度下，根和芽的长度随着盐浓度增加而变短，与对照组相比差异显著(P<0.05)。相同盐处理下，SA较低浓度时的根、芽长度最长。

以上结果表明，低浓度盐能促进红三叶种子的萌发。适宜低浓度水杨酸浓度浸种，盐胁迫下种子的萌发得到促进，高浓度则不利于种子萌发。SA 0.1 mM为盐胁迫下萌发的最适宜浓度，0.3 mM对根与芽生长的促进作用最明显(图2)。

图2 红三叶萌发指标

3.3 SA对盐胁迫下高加索三叶草萌发的影响

盐胁迫使发芽率降低，相同水杨酸浓度下，盐浓度为100 mM的发芽率显著低于对照(P<0.05)。在相同盐处理下，盐浓度为0 mM时，除SA为0.1 mM以外的其他浓度显著低于对照58.11%(P<0.05)。盐浓度为50 mM，SA为0.1 mM发芽率与对照相比差异不显著(P>0.05)，其余浓度差异显著(P<0.05)。盐浓度为100 mM时，除SA为0.1 mM的其它浓度，随SA浓度增大发芽率逐渐降低，与对照相比差异显著(P<0.05)。

相同水杨酸浓度下，除SA为0.5 mM、仅有盐浓度为100 mM发芽势差异显著(P<0.05)。在相同盐处理下，盐浓度为0mM时，SA为0.2 mM发芽势最低为39.33%， 0.5 mM发芽势最高为54%，与对照相比差异不显著(P>0.05)。盐浓度为50 mM时，与对照相比差异不显著(P>0.05)。盐浓度为100 mM时，SA为0.4 mM发芽势最高，与对照相比差异显著(P<0.05)。

盐胁迫使发芽指数降低，相同水杨酸浓度下，发芽指数呈现随着盐浓度增加而降低的趋势。在相同盐处理下，盐浓度为0 mM时，各水杨酸处理发芽指数显著低于对照21.12(P<0.05)。盐浓度为50 mM时，SA为0.3 mM发芽指数最高为18.02，显著高于对照11.45(P<0.05)。盐浓度为100 mM时 SA为0.3 mM发芽指数9.58为最高，与对照相比差异显著(P<0.05)，0.5 mM发芽指数9.58为最低，差异显著(P<0.05)。

盐胁迫使活力指数降低，相同水杨酸浓度下，活力指数呈现随着盐浓度增加而降低的趋势。在相同盐处理下，盐浓度为0 mM时，SA为0.05 mM的活力指数最低为0.5，差异显著(P<0.05)。当盐浓度为50 mM，差异不显著(P>0.05)。当盐浓度为100 mM，SA为0.3 mM时的活力指数最高，与对照相比差异显著(P<0.05)。

盐胁迫使根长、芽长均受到抑制，在相同水杨酸浓度下，根与芽的长度随着盐浓度增加而变短，与对照组相比差异显著(P<0.05)。在相同盐处理下，0.3 mM、0.4 mM水杨酸处理促进盐胁迫下的根长、芽长。

以上结果表明，盐胁迫使高加索三叶草种子的萌发受到抑制。适宜低浓度水杨酸浸种可以提高盐胁迫下高加索三叶草种子的萌发能力，高浓度的水杨酸会抑制种子萌发，0.3 mM SA为最适宜浓度(图3)。

图3 高加索三叶草萌发指标

3.4 SA对盐胁迫下高加索三叶草与白三叶杂交后代萌发的影响

相同水杨酸处理下，SA为0.3 mM，盐浓度为50 mM发芽率显著高于0 mM盐处理发芽率(P<0.05)，100 mM盐处理显著低于对照(P<0.05)。在相同盐处理下，盐浓度为0 mM时，除SA为0.1 mM的发芽率的其他浓度，显著低于对照(P<0.05)。盐浓度为50 mM，发芽率随SA浓度的增加降低。盐浓度为100 mM时，SA为0.4 mM时发芽率最高。

相同水杨酸浓度下，SA为0.2和0.3mM，50 mM盐处理下发芽势最高，其它随着盐浓度的增加而降低。在相同盐处理下，盐浓度为0mM时，SA为0.2 mM发芽势最低为36.67%，与对照相比差异显著(P<0.05)。盐浓度为50 mM时，SA为0.1 mM发芽势最高54.67%。盐浓度为100 mM时，SA为0.1 mM发芽势最高，与对照相比差异显著(P<0.05)。

相同水杨酸浓度下，除对照外盐浓度为50 mM发芽指数最高，100 mM发芽率最低。在相同盐处理下，盐浓度为0 mM时，SA为0.3 mM的发芽指数19.73为最高，与对照相比差异显著(P<0.05)。盐浓度为50 mM时，SA 各浓度与对照相比差异显著(P<0.05)。盐浓度为100 mM时，SA各浓度与对照相比差异显著(P<0.05)。

相同水杨酸浓度下，除对照以外，50 mM活力指数最高。在相同盐处理下，盐浓度为0 mM时，SA为0.3 mM时的活力指数0.6为最高。当盐浓度为50 mM，SA为0.2 mM活力指数0.68为最高。当盐浓度为100 mM，SA 各浓度与对照比差异显著(P<0.05)，但与SA为0 mM差异不显著(P>0.05)。

盐胁迫抑制该品系根长、芽长，在相同的浓度水杨酸下，盐浓度增加使根与芽的长度越短，与对照组相比差异显著。相同盐处理下，SA较低浓度时根、芽长度最长。

结果表明，盐浓度的增加使该品系的萌发能力逐渐减弱。低浓度盐促进使高加索三叶草与白三叶杂交后代种子的萌发，高浓度阻碍萌发。50 mM盐胁迫下，0.3 mM SA为最适宜浓度。100 mM盐胁迫下，0.4 mM SA为最适宜浓度(图4)。

图4 高加索三叶草与白三叶杂交后代萌发指标

3.5 基于灰色关联度的不同品系处理的分析

由于测定的单个指标无法准确判断出最优品系及处理组合，所以本文选用灰色关联综合测定的6个萌发指标对发芽状况综合评判，分别选出4种三叶草中最优处理组合及最耐盐品种。

将参试的4个品种共72个处理组合所测定的6个指标作为一个灰色关联系统，求得每个处理组合6个指标的等权关联度，最后根据等权关联度的值评判最佳处理组合与品系。

由灰色系统内的关联系数计算得出不同品系不同处理各指标的等权关联度，值越大则说明该品系的处理组合综合效果越好。计算结果如表2所示。CK1关联度最高为0.880，即不进行盐胁迫与水杨酸处理时白三叶萌发最好，其次是H5和H4(仅用0.5 mM、0.4 mM SA处理的白三叶)。由表2可知L7关联度为0.726，即红三叶用50 mM NaCl、0.1 mM SA处理组合综合表现最好。仅进行盐胁迫和盐胁迫与水杨酸共同处理时，红三叶综合表现最好。

表2 参试品系加权关联度及排名

4 讨论

盐胁迫下植物生物量减少是一种普遍现象。有大量报告表明盐胁迫对不同植物的生物量产生了不利影响[16]。在本次试验中也得到了几乎类似的结论。据报道，通过外源SA浸种可有效的增加盐胁迫下植物的生物量[17]。在植物生命周期内，外部环境和内部生理生化共同影响着种子萌发以及幼苗的形态建成，盐害对种子萌发阶段不利影响极大。盐胁迫会引起植物细胞渗透胁迫，种子吸水受阻，种子内的营养物质不能分解而释放能量，胚得不到有效的养分供给，最终种子萌发受到抑制。

盐胁迫下种子发芽率低的主要原因是渗透效应[18]。有研究表明，作为一种植物生长调节剂，SA可通过降低籽粒淀粉含量来克服盐胁迫对水稻(OryzaSativaL.)种子萌发的抑制作用[19]，外源SA还能缓解盐胁迫对孔雀草(TagetespatulaL.)种子萌发的影响[20]。赵春旭[21]研究外源水杨酸对高羊草耐盐胁迫时发现，低浓度的水杨酸可减轻高羊草的盐害，高浓度的水杨酸不能减轻盐胁迫的危害；曹克璠等[22]以“蒙农三叶草1号”为材料研究了不同浓度水杨酸浸种对其种子萌发及幼苗生理特性的影响，结果显示，盐胁迫下，低浓度的水杨酸(0.1，0.2，0.3 mM)浸种会抑制种子的萌发及幼苗生长；而高浓度的水杨酸(0.4，0.5 mM)浸种则可以缓解盐处理对“蒙农三叶草1号”的伤害。以上研究结果与本研究得到了相似的结果。

5 结论

以4个三叶草品种的种子为试验材料，采取裂区试验设计(盐胁迫为主处理，水杨酸浸种为副处理)，探究了水杨酸对盐胁迫下三叶草种子萌发的影响。得到了如下结果：

(1)盐胁迫使高加索三叶草4个杂交后代种子的萌发能力下降，盐浓度的越高，种子萌发状况越差。

(2)适宜的低浓度水杨酸可促进盐胁迫4个三叶草品种种子的萌发。盐胁迫下，白三叶最适宜萌发的水杨酸浓度为0.1 mM，0.3 mM分别对根、芽的促进作用最明显。红三叶最适宜萌发的水杨酸浓度为0.4 mM；高加索三叶草最适宜SA浓度为0.3 mM；高加索三叶草与白三叶杂交后代最适宜SA浓度为0.3 mM 。

(3)基于灰色关联度综合分析评价了各处理组合的萌发状况。种子在低浓度水杨酸和盐胁迫的处理组合下综合表现好，红三叶耐盐性综合表现最好。