冬眠动物冬眠适应性的分子调控机制研究进展

2023-03-07张继辉赵丹丹

商丘师范学院学报 2023年9期

张继辉,赵丹丹

(芜湖职业技术学院食品科学与生物工程学院,芜湖生命与健康工程研究中心,安徽芜湖 241003)

1 冬眠物种的转录组研究进展

1.1 转录组

转录组指某一生理条件下的某一特定组织或细胞中全部转录产物的集合.一般认为主要由核糖体RNA (80%-90%,rRNA)、转运RNA (5%-15%,tRNA)、mRNA (2%) 和一小部分非编码RNA (1%,ncRNA) 比如lncRNA和miRNA等组成[1].转录组的典型特点是具有时空性,即在特定的细胞或者组织的不同发育阶段,其转录组也不同,同一组织中不同细胞类型的转录组也不完全相同[2].在不同物种的不同组织中开展转录组研究,有利于了解特定组织或细胞在不同时期时的分子间相互作用.

1.2 冬眠物种转录组学研究进展

通过转录组学方法已经确定了十三纹地松鼠棕色脂肪组织和白色脂肪组织[3]、骨髓[4]、大脑皮层和下丘脑区域[5]以及骨骼肌和心脏[6]在不同活动状态以及不同活动季节下的基因表达.采用抑制消减法杂交技术和斑点杂交技术,对马铁菊头蝠 (Rhinolophusferrumequinum) 冬眠和觉醒状态大脑中的差异表达基因进行了系统的研究,发现冬眠状态表达上调的基因有41个,其中已知基因17个,生物信息学分析表明,主要的上调基因可能负责基因表达的调控、信号转导和神经保护、细胞周期和凋亡的调控、神经元的生长和细胞内的转运.同样在马铁菊头蝠中,通过转录组测序技术对冬眠和活动状态大脑中的差异基因进行了全面研究,鉴定了1573个差异表达基因,发现差异基因在代谢抑制、细胞应激反应和氧化应激等GO条目中显著富集,表明神经保护策略可能在冬眠控制机制中发挥重要作用[7].在侏儒狐猴 (Cheirogaleuscrossleyi) 中,比较两种活跃状态和一种休眠状态时的白色脂肪组织 (white adipose tissue) 中差异表达基因时,鉴定了90个具有可变表达模式的候选基因,这些与代谢途径、摄食行为和昼夜节律有关的基因,可能与季节生理状态的变化相关,对维持动物的健康至关重要,因为动物处在冬眠表型的同时也经历了长时间的代谢抑制[8].在马达加斯加岛,使用标记重补技术来跟踪相同的野生侏儒狐猴,通过RNA-seq技术比较了白色脂肪组织在3种不同生理状态下的基因表达谱,指出丙酮酸脱氢酶激酶同工酶4 (pyruvate dehydrogenase kinase 4) 在食物严重匮乏时,调节燃料的经济性转变中发挥关键作用[9].Fedorov等利用cDNA探针芯片技术来检测黑熊冬季冬眠期间与夏季活动期间心脏和肝脏中基因的表达差异,鉴定了心脏中245个基因和肝脏中319个基因在冬季和夏季之间表达差异,其中有24个基因同时在心脏和肝脏中表达显著升高,这些基因主要参与脂质分解代谢和蛋白质生物合成,其中包括RNA结合蛋白基序3 (RNA binding motif protein 3),可在轻度低温下增强蛋白质合成,这可能与熊冬眠期间长时间低代谢和休眠期间心肌和肌肉萎缩的适应性机制有关[10].Nespolo等通过高通量测序技术 (RNA-seq) 比较了冬眠和活跃状态下的南美有袋动物 (Dromiciopsgliroides) 的大脑、肝脏和骨骼肌组织中的基因表达,并确定冬眠是否诱导了组织特异性的差异基因表达,这些差异表达基因编码的蛋白质反映冬眠期间的多种代谢变化,如防止肌肉废用性萎缩、碳水化合物向脂质代谢转换、抗氧化保护和修复受损DNA等[11].

随着高通量测序技术的进步,转录组测序技术也逐渐被用来研究爬行动物的冬眠生理变化.本团队之前已经利用转录组测序技术对冬眠和活动的扬子鳄心脏、骨骼肌和肾脏的基因表达差异进行了全面的调查,总共发现了4780个基因在扬子鳄活动期和冬眠期之间的差异表达,部分差异表达基因在冬眠期表达升高,对提高胰岛素敏感性、糖脂代谢以及保护细胞免受低温和缺氧的伤害中起重要作用[12].Capraro等使用mRNA-seq分析了澳洲鬃狮蜥 (Pogonavitticeps) 3种组织内的基因表达,样本来自冬眠后期、觉醒后2 d和觉醒后2个月的动物的大脑、心脏和骨骼肌[13].他们发现脑组织中差异表达基因有4264个,心脏种差异表达基因5340个,骨骼肌种差异表达基因5587个.3种组织中共表达的差异基因有2482个,差异基因的组织特异性分析显示在所有组织中都有丰富的保护机制,包括大脑中的神经保护通路、心脏中的心肌肥厚过程和骨骼肌萎缩的保护通路.在所有组织中,冬眠期间均诱导了应激反应通路,并在转录、翻译和翻译后进行基因表达调控.Lin等对扬子鳄的多个组织进行了转录组学分析,探讨扬子鳄冬眠的机理,发现甲状腺激素的生物合成、营养吸收和代谢、肌肉收缩、尿排泄和免疫功能通路在冬眠过程中整体下调[14].

2 非编码RNA在冬眠物种中的研究

2.1 非编码RNA的介绍

基因组中编码蛋白质的基因外显子仅占基因组的1.5%,如果考虑非编码区,该比例也只会增加到2%[15].大量研究显示,基因组的非蛋白质编码部分对机体的正常发育、生理适应和疾病等具有至关重要的功能[16,17].近年来非编码RNA (non-coding RNA,ncRNAs) 在组织和细胞中的转录调控机制已经被广泛研究[18,19].非编码RNA主要包括长度大于200 bp的长链非编码RNA和长度小于200 bp的短链非编码RNA,具体的有lncRNA,miRNAs和circRNAs,以及经典的tRNA,rRNA和 snoRNAs等等[16,20].

2.2 miRNA对冬眠物种基因表达的调控

miRNA的平均长度在18～26 nt之间,是一种内源性非编码小RNA,作为转录后调节因子,据报道主要位于动物、植物和真菌基因组的非编码区[21].Bigger等人指出,在低温、缺食和缺氧等条件下,miRNA可以参与调控机体内多种生理变化,暗示miRNA在冬眠适应性的分子调控中起作用[22,23].miRNAs对哺乳动物冬眠的调节已经在许多物种中进行了探索.例如,通过比较10个miRNAs在常温蝙蝠和冬眠蝙蝠中的表达,结果显示,与常温对照相比,在冬眠蝙蝠的胸肌中,观察到8个成熟miRNAs的转录本表达显著增加,包括miR-29b,miR-1a-1,miR-181b,miR-15a,miR-206,miR-20a和miR-128-1.这些miRNA已经被证实或被预测会影响多种肌肉特异性因子,包括肌生成抑制素、FoxO3a、HDAC4和SMAD7,并且可能参与了蝙蝠冬眠期间胸肌质量和功能的保存[24].同样利用RT-PCR技术在蝙蝠脑组织中发现8种microRNAs (miR-21、-29b、-103、-107、-124a、-132、-183和-501) 在冬眠状态下表达增加,提示冬眠期间与神经元分化和适应性神经保护相关的脑功能可能受到miRNA的控制[25].通过RNA-seq测序技术,对冬眠蝙蝠 (Myotisricketti) 的大脑和白色脂肪组织中的miRNA进行了基因组分析,196个miRNA 被鉴定获得 (包括77个新的蝙蝠特异性miRNA),其中49个miRNA在冬眠期间表现出显著差异,其中33个在大脑中表达,25个在WAT中表达,提示冬眠期间大脑和脂肪组织中的一些生理通路被激活[26].冬眠期北极黄鼠的肝脏中miR-320、mir-378表达下调[27],并探究了他们在冬眠中的潜在作用,指出miR-320和miR-378可以抑制冬眠期细胞的生长.在地松鼠肝脏、心脏和骨骼肌组织中通过qRT-PCR检测出冬眠肝脏中,miR-29a、miR-152、miR-195、miR-223和miR-486表达上调,而在冬眠骨骼肌组织样本中,miR-378表达下调,其中miR-195靶点基因编码的脂肪酸合酶 (fatty acid synthase,FAS),在冬眠的地松鼠肝脏中下调,为冬眠动物体内脂肪酸稳态的潜在调控提供了线索[28].在非哺乳动物中,低温照射下的差异miRNA的表达也可以在玉黍螺和锦龟中观察到[29,30].在寒冷条件下,在林蛙 (Ranasylvatica) 的肝脏和骨骼肌中,miR-21在冻结期间明显增加了1.5倍和1.3倍,在冻结期间的肝脏中,miR-16转录也显著升高1.5倍,而在骨骼肌中则下降50%[31],这表明miRNA在两栖冬眠的抗冻能力的适应性调节中起作用.Lin等使用扬子鳄脂肪、大脑、心脏、小肠、肌肉和性腺组织进行了sRNA-seq,以识别季节偏性差异表达的miRNA.一些在其他冬眠动物中发挥作用的与冬眠相关的miRNA在扬子鳄中也有发现,例如,miR-103、miR-124 (脑) 和miR-206 (骨骼肌) 在冬眠鳄鱼中上调;同时还发现了新的与冬眠相联系的miRNA,例如,在冬眠期间,miR-10b在小肠和脂肪组织中表达上调,而在大脑、心脏、肌肉和卵巢中表达下调[14].

2.3 lncRNA对冬眠物种基因表达的调控

长链非编码RNA(lncRNA) 最早是1988年在小鼠中被发现的,H19被鉴定为肝脏发育过程中一种没有大的开放阅读框 (ORF) 的RNA,而是零散的小ORF,这些ORF不具有进化保守性,不能在体内被翻译,也不能产生可检测的多肽[32].lncRNA的主要特点是没有编码功能,没有大的开放阅读框,一般长度大于200 nt[33].最开始研究者认为lncRNA在生物体内没有生物学功能,仅仅基因转录过程中产生的“噪音”[34].然而,随着高通量测序大规模的筛选,越来越多的lncRNA被发现,其生物学功能也逐渐被解析,如lncRNA可能在多细胞生物发育过程中,调控细胞分化的多样性[35];哺乳动物lncRNAs的表达比mRNAs表现出更大的组织特异性,这表明lncRNA可能参与了组织特异性调控[36].

许多研究讨论了lncRNA在动物冬眠时表达异常,但对lncRNA基因差异表达中的调控机制的研究还很少.最初的报道发现冬眠纹黄鼠心脏和白色脂肪组织中,在不同阶段lncRNA metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1 (MALAT1) 表达波动很大,尤其在10月份表达量最高[37],MALAT1在哺乳动物中高度保守,已知其可以参与RNA剪接的调控[38].有研究表明在冬眠小棕蝠骨骼肌中的lncRNA,反义缺氧诱导转录因子(antisense hypoxia-inducible transcription factor,aHIF) 表达下调[39].aHIF与缺氧诱导因子 (hypoxia inducible factor 1 subunit alpha,hif-α) 的3’ UTR互补,与hif-α mRNA结合从而促进其降解[40],而hif-α蛋白的数量和活性在冬眠期间升高,aHIF的减少可能与这些变化有关[41].在十三纹地松鼠中,与活动期常温个体相比,lncRNA taurine-upregulated gene 1 (TUG1) 在冬眠期的骨骼肌中上调[42].TUG1可促进癌细胞增殖并抑制细胞凋亡[43,44],并可以预防小鼠冷诱导导致的组织损伤[45].TUG1还可以功能性地调节线粒体的生物发生[46],并可能在应对环境压力方面发挥额外作用.TUG1被认为通过充当miR-144的诱饵并通过竞争抑制降低热休克因子2 (heat shock factor 2,HSF2) 的表达,HSF2是一种促进热休克蛋白表达的转录因子[47].TUG1和其他lncRNAs在动物冬眠中的作用还需要进一步的研究来确定.

3 DNA甲基化在冬眠物种中的研究

3.1 DNA甲基化的形成

DNA甲基化是目前研究的最多且最为深入的一种表观遗传学因素,在1975年首次被研究者发现,也是脊椎动物遗传过程中的主要调控因素[48,49].DNA甲基化修饰是有S-腺苷甲硫氨酸提供甲基,以共价键的形式与胞嘧啶核苷酸的5号碳原子结合,形成5-甲基胞嘧啶,这种修饰方式广泛且稳定存在于动植物以及真菌体内[50].在动物体内,DNA甲基化修饰主要发生在CpG丰富的区域,即CpG岛.CpG岛在基因组中的分布不均匀,其中在基因的启动子区富含数量较多的CpG岛,但通常启动子区的CpG位点保持低甲基化状态.甲基CpG结合区域蛋白阻碍转录因子和RNA聚合酶与模板链的结合以便抑制基因转录,影响对应的基因表达水平,最终导致机体发生相应的生理功能变化.重要的是CpG岛区域内的胞嘧啶甲基化起到强烈抑制基因转录的作用,能导致长期的等位基因沉默,如X染色体失活[51].近年来,DNA甲基化研究越来越深入,基因编码区的DNA甲基化对基因表达的调控也逐渐被解析,与启动子区域DNA甲基化对基因表达调控有显著差别.编码区的DNA甲基化不仅可以抑制基因表达,有些区域的甲基化同时可以促进基因的表达[52].

3.2 DNA甲基化在冬眠物种中的研究

DNA甲基化在动物冬眠中的作用研究的还不是很多.在十三纹地松鼠中,棕色脂肪组织的全基因组甲基化显示在冬眠期间个体与常温个体对照相比,整体DNA甲基化增加了1.7倍[53].此外,在金花鼠肝脏中发现休眠特异性蛋白27 (hibernation-associated plasma protein HP-27-like,HP-27) 基因表现出特异的转录表达,分析原因发现,在肝脏组织中HP-27基因的启动子区域CG位点的甲基化水平很低,从而有利于刺激因子-1 (upstream transcription factor 1,USF1) 在启动子区域与之结合,进而促进了HP-27基因的表达[54];而在肾脏和心脏中,HP-27启动子区CpG岛发生高甲基化修饰,从而阻碍了USF1的结合,HP-27转录被抑制.通过评估十三纹地松鼠冬眠后肝脏和骨骼肌中DNA甲基化的整体变化,以及DNA甲基转移酶 (DNA methyltransferases,DNMT1/3B) 和甲基结合结构域蛋白 (methyl binding domain proteins,MBDs) 的表达变化,发现肌肉在麻木期整体DNA甲基化减少,而DNMTs和MBDs在这两个组织中均有显著变化.结果显示在冬眠期间,基因组DNA甲基化是动态的,与冬眠表型相适应[55].扬子鳄的多个组织全基因组甲基化结果显示冬眠相关基因不仅直接受到DNA甲基化的调控,还受到甲基化依赖的转录网络的调控[14].